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《大鼠提睪肌血管肽類免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維的分布》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、大鼠提睪肌血管肽類免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維的分布關(guān)鍵字：睪肌血管 自20世紀(jì)80年代初至今，包括降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide’CGRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptideY’NPY)、5羥色胺(5-hydroxytryptamine’5-HT)、P物質(zhì)(substanceP’SP)和甲硫氨酸腦啡肽(methionineenkephalin’M-ENK)等一批對(duì)血管生理功能有重要影響的神經(jīng)活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)［1，2］，為微循環(huán)的神經(jīng)調(diào)節(jié)增加了新的內(nèi)容.大白鼠提睪肌微循環(huán)研究動(dòng)物模型是上述研究的重要材料和手段［3］，但
2、其血管上的神經(jīng)活性物質(zhì)分布情況還未見報(bào)道.血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性、功能及損傷均與微循環(huán)障礙有關(guān)［4，5］，上述各種活性物質(zhì)是否對(duì)其產(chǎn)生影響還無形態(tài)學(xué)依據(jù).我們擬采用大白鼠提睪肌模型，對(duì)神經(jīng)活性物質(zhì)在各級(jí)血管上的分布進(jìn)行研究，為血管損傷后微循環(huán)障礙病理生理改變機(jī)制研究和完善利用大白鼠提睪肌血管微循環(huán)研究模型打下一定的基礎(chǔ). 1 材料和方法 1.1 材料 兔抗CGRP及NPY抗體(使用效價(jià)1∶5000)由英國(guó)Polak教授惠贈(zèng)，Sp’5-HT及M-ENK(使用效價(jià)1∶3000)由第四軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎教研室生產(chǎn).生物素標(biāo)記豬抗兔IgG抗體(使用效價(jià)1∶800
3、)及卵白素生物素復(fù)合物(ABC)，使用效價(jià)1∶200)為丹麥Dako公司產(chǎn)品.3.3-四鹽酸二胺基聯(lián)苯胺(DAB)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品. 1.2 方法 成年雄性SD大鼠30只，平均分為CGRP’NPY’SP’5-HT及M-ENK共5組.所有動(dòng)物均以10g・L-1’ip戊巴比妥鈉溶液麻醉，開胸后經(jīng)主動(dòng)脈插管，依次灌入9g・L-1生理鹽水100mL及30g・L-1多聚甲醛磷酸緩沖液300mL.切開一側(cè)腹股溝區(qū)皮膚，顯露提睪肌，從其腹側(cè)剪開向兩側(cè)展開，將睪丸推入腹股溝深處.在肉眼和解剖鏡下仔細(xì)剝離提睪肌上的小動(dòng)脈(精
4、素外動(dòng)脈)，在肉眼下，從動(dòng)脈起始部，至末端分支共分3級(jí).另一側(cè)提睪肌展開后，以動(dòng)脈為中心將肌片取下，剝除血管表面肌組織以顯露動(dòng)脈便于免疫組化反應(yīng).所有組織置固定液后固定48h.免疫組織化學(xué)染色按ABC法操作.血管及組織片先入甲醇雙氧水以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再入3g・L-1牛血清Triton液封閉1h.各組材料分別依次進(jìn)兔抗CGRP’NPY’SP’5-HT及M-ENK抗血清、生物素標(biāo)記豬抗兔IgG血清及卵白素-生物素復(fù)合物，最后以DAB呈色反應(yīng)20min.在染色過程中，每次進(jìn)入抗血清前均以PBS緩沖液震蕩漂洗3遍，每遍5min.進(jìn)入抗血清后
5、，先于恒溫箱37℃孵育30min，后置4℃冰箱過夜.用PBS和正常牛血清分別代替第一抗體，用PBS代替第二抗體或ABC免疫復(fù)合物進(jìn)行代替試驗(yàn)以做對(duì)照. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用交點(diǎn)計(jì)數(shù)法進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)：在×10Olympus目鏡下，計(jì)數(shù)與纖維長(zhǎng)軸垂直的任一0.1mm目鏡網(wǎng)格線上纖維相交數(shù)量，每個(gè)血管分支任選3個(gè)視野同法計(jì)數(shù)，其平均值為本段血管神經(jīng)纖維的密度.平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差以X±s表示，方差t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理. 2 結(jié)果 提睪肌動(dòng)脈及帶血管組織片經(jīng)ABC法染色后，各抗體免疫陽性纖維呈金黃色或淡黃色，各抗體著色一致，背景染色淺淡.對(duì)照試驗(yàn)均為陰性. 2.1 CGR
6、P陽性纖維和終末的分布特點(diǎn) CGRP陽性纖維和終末廣泛分布于提睪肌動(dòng)脈各級(jí)分支中，但隨著動(dòng)脈的分支陽性纖維和終末明顯減少’各級(jí)分支間陽性纖維和終末數(shù)量差別明顯(P＜0.01’Tab1).在第1級(jí)分支，陽性纖維和終末呈濃密顆粒狀，局部呈濃度斑塊狀.所有陽性纖維圍繞動(dòng)脈形成網(wǎng)狀分布，其中有線狀和串珠狀結(jié)構(gòu)(Fig1).在稍細(xì)的第2級(jí)分支中，陽性纖維有所減少，其形態(tài)與第1級(jí)分支相同(Fig2).至第3級(jí)分支以下，陽性纖維和終末明顯減少，但顆粒狀、線狀、串珠狀和網(wǎng)狀纖維的很明顯，其中呈網(wǎng)狀和與血管長(zhǎng)軸垂直之橫行排列纖維也常見到(Fig3).在10μm以下毛細(xì)血管壁上
7、仍能見到分散呈顆粒狀陽性終末，局部可見色較淡之網(wǎng)狀纖維分布.在毛細(xì)血管分叉處環(huán)繞該處之陽性纖維更為顯著(Fig4). 3 討論 血管生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)包括神經(jīng)調(diào)節(jié)，體液調(diào)節(jié)和自身調(diào)節(jié).其中周圍神經(jīng)的調(diào)節(jié)通過交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)、脊髓背根舒血管神經(jīng)纖維、血管活性腸肽及血管內(nèi)在神經(jīng)釋放乙酰膽鹼、腎上腺素、去甲腎上腺素、胺類及肽類等活性物質(zhì)對(duì)血管的舒縮功能產(chǎn)生影響［2，6］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明.大白鼠提睪肌血管各級(jí)分支均有CGRP’NPY’SP’5-HT及M-ENk免疫陽性纖維和終末分布.根據(jù)NPY與去甲腎上腺素(norepinephrine’NE)免疫陽性纖維分布區(qū)
8、相同，認(rèn)為NPY是交感性的，但目前對(duì)這些活性物質(zhì)來自
