人、大鼠、樹(shù)鼩肝癌組織中細(xì)胞周期蛋白b2的表達(dá)及其意義

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1、人、大鼠、樹(shù)駒肝癌組織中細(xì)胞周期蛋白B2的表達(dá)及其意盧曉旭1、2曹驥2(通訊作者)(1廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院廣西南寧530021；2廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研宄所廣西南寧530021)【摘要】目的：研究細(xì)胞周期通路屮的細(xì)胞周期蛋白B2(CyclinB2,Ccnb2)在人、大鼠、樹(shù)駒不同種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織屮的表達(dá)和意義。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(Q-PCR)技術(shù)檢測(cè)人、大鼠、樹(shù)駒屮CyclinB2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：CyclinBImRNA在人、人鼠和樹(shù)駒的肝癌屮表達(dá)水平均高于正常肝組織(均為P<0.05);在人肝癌組織屮的表達(dá)高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(

2、P<0.05);在大鼠、樹(shù)駒癌旁組織屮的表達(dá)高于正常肝組織(P<0.05)；其余各組織間mRNA表達(dá)水平的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。結(jié)論：CyclinB2有可能是影響肝癌發(fā)生和發(fā)展的重要分子之一?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞周期蛋0B2跨種屬肝癌熒光定量PCR【中圖分類(lèi)號(hào)】R730.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】2095-1752(2013)07-0045-02跨種屬篩選腫瘤棊因策略是指［1］通過(guò)探索比較某些腫瘤在不同種屬的基因表達(dá)譜屮共同擁有的基因改變，篩選出該腫瘤發(fā)生發(fā)展屮起關(guān)鍵作用的分子。基于這一認(rèn)識(shí)，本課題組前期［2】通過(guò)生物信息學(xué)方法，在人和小鼠的

3、肝癌基因芯片屮篩選出CyclinB2棊因在差異表達(dá)上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研宄擬通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)CyclinB2在人、人鼠和樹(shù)駒三個(gè)種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織屮的表達(dá)，探討CyclinB2在肝癌發(fā)生發(fā)展屮的可能作用及意義。1材料與方法1.1標(biāo)本收集1.1.1人肝組織標(biāo)本收集廣西醫(yī)科人學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年1月?2011年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的38例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織和10例正常肝組織，正常肝組織來(lái)源于肝良性占位病變經(jīng)手術(shù)切除者。肝癌病人術(shù)前均無(wú)放療化療史。1.1.2大鼠和樹(shù)駒肝組織標(biāo)本課題組前期項(xiàng)0己建立用黃曲霉毒素Bl（aflatoxinBl,AFB

4、l）誘導(dǎo)肝癌的大鼠及樹(shù)駒動(dòng)物模型。此次實(shí)驗(yàn)取大鼠肝癌及其相應(yīng)癌旁組織各15例、正常肝組織14例，以及樹(shù)駒肝癌及其相應(yīng)癌旁組織10例、正常肝組織10例。1.2主要試劑與儀器RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司（美國(guó)），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物純化采用杭州博日公司的Biospin膠回收試劑盒，熒光定量試劑盒為T(mén)aKaRa寶生物工程（大連）有限公司的SYBR?PremixExTaq?（PerfectRealTime）試劑盒。實(shí)時(shí)焚光定量PCR儀為Chromo4RealTimedetector。

5、1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1總RNA提取（Trizol法）及RNA質(zhì)量驗(yàn)證采用Trizol試劑提取組織總RNA。每例取2ulRNA用微量分光光度id?測(cè)其OD260/280值和濃度。RNA樣本的純度值（A260nm/A280nm）1.8?2.0為合格。以1.0%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)所提取的總RNA的完整性;將每例樣本按所測(cè)濃度加水稀釋成lug/ul后，置于-80°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2cDNA制備取檢驗(yàn)合格的RNA，按Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，產(chǎn)物于-20°C保存。1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)CyclinB2的上、下游引物序列

6、分別為5′CAGGAGACTCTGTACATGTGCG3′和5′TTCTCGGATTTGGGAACTGG3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度為195bp。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別構(gòu)建CyclinB2和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣本中初始mRNA相對(duì)表達(dá)量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理；各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA);檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果

7、2.1總RNA質(zhì)量及基因測(cè)序所有樣本總RNA的OD260/OD280比值在1.8?2.05之間，瓊脂糖凝膠電泳后成像顯示28S、18S、5S條帶清晰，提示總RNA質(zhì)量較好。2.2實(shí)時(shí)熒光定量-PCR反應(yīng)CyclinB2和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性好,直線(xiàn)擬合度良好;擴(kuò)增曲線(xiàn)均呈S型，顯示擴(kuò)增結(jié)果理想。熔解曲線(xiàn)峰形窄而尖，峰單一無(wú)雜峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。2.3CyclinB2mRNA在人、大鼠、樹(shù)駒的肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量-PCR結(jié)果分析顯示，人肝癌組織CyclinB2mRNA的表達(dá)量(0.