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《全長(zhǎng)cdna主要構(gòu)建方法的比較》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、全長(zhǎng)cDNA主要構(gòu)建方法的比較摘要全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建是進(jìn)行功能基因組研究的一種經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑，克服了傳統(tǒng)cDNA文庫的缺點(diǎn)，本文主要介紹了兩種較為實(shí)用的方法，分別是SMART法和Captrapper法。關(guān)鍵詞：全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建SMART法Captrapper法隨著測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的不斷發(fā)展，大部分生物和人類的基因組全序列測(cè)定高速完成。cDNA作為基因克隆的一種重要工具，在幫助人們更好的發(fā)現(xiàn)新基閃和研究基閃功能上發(fā)揮了巨大的作用。但是，由于傳統(tǒng)的cDNA由于反轉(zhuǎn)錄能力差，cDNA酶切位點(diǎn)保護(hù)不徹
2、底和非cDNA片段插入導(dǎo)致克隆片段短、無效克隆多和全長(zhǎng)率低等缺點(diǎn)，因而無法滿足人規(guī)模、高通量、高效的功能基因組研究需要。而全長(zhǎng)cDNA序列大多數(shù)擁有5'和3’端非編碼區(qū)序列，因而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)cDNA文庫構(gòu)建方法的缺陷，成為目前基因克隆的一種重要方法。目前主要有CAPture法，Oligocapping法，SMART法，Capjumping法以及Captrapper法。本文主要介紹優(yōu)點(diǎn)突出的兩個(gè)方法，SMART法和Captrapper法。SMART方法SMART方法是Chenchik等1996年提出的［3］,該方
3、法利用PowerscriptTMRT反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄、末端轉(zhuǎn)移活性和內(nèi)切酶sfil的特性，快速、簡(jiǎn)單地構(gòu)建企長(zhǎng)cDNA文庫。PowerscriptTMRT反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLVR點(diǎn)突變而來的，喪失了RnaseH的活性，但保留著野生型聚合酶轉(zhuǎn)移酶的活性，能夠長(zhǎng)距離的反轉(zhuǎn)錄，乂可識(shí)別mR-NA5’帽子結(jié)構(gòu)。原始一鏈合成中，轉(zhuǎn)移酶的活性低，延伸效率低。用于反轉(zhuǎn)錄的5’端poly（A）引物和延伸模板分別含有sfil（A）、sfil（B）識(shí)別位點(diǎn)的寡聚核苷酸序列。而截短的一鏈cDNA,反轉(zhuǎn)錄酶沒有識(shí)別到mRNA5’帽子結(jié)
4、構(gòu)，一鏈CDNA3/端不能被延伸、合成和擴(kuò)增二鏈。兩端含有sfil識(shí)別位點(diǎn)的全長(zhǎng)cDNA,經(jīng)兩種類型（A、B）內(nèi)切酶sfil酶切，使兩端產(chǎn)生不同的粘性末端，而全長(zhǎng)cDNA內(nèi)部由于sfil識(shí)別位點(diǎn)在基因組屮很少見而得以保護(hù)，這樣就實(shí)現(xiàn)了目的全長(zhǎng)基因的高效定向克隆。與其他方法相比，此方法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)（1）所需起始材料少，一般O.5~lugmRNA（2）mRNA在合成cDNA前無耑任何酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)處理，不會(huì)導(dǎo)致處理過程中mRNA的降解和損耗。（3）實(shí)驗(yàn)過程快速、簡(jiǎn)單，整個(gè)過程沒有對(duì)mRNA和屮間產(chǎn)物的復(fù)雜處理
5、。（4）全長(zhǎng)比例較高［13］。SMART方法也有其自身明顯的缺點(diǎn)（：1）PCR擴(kuò)增具有選擇性，不利于長(zhǎng)片段序列的擴(kuò)增，使一些長(zhǎng)片段的全長(zhǎng)基因丟失，不易得到大于3kb片段和低峰度全長(zhǎng)基因［13］2）dG加尾效率低，導(dǎo)致文庫中基因信息丟失，文庫缺乏代表性。在實(shí)際應(yīng)川屮，該方法快速、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)使之廣受青睞［14?17］，尤其是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域屮應(yīng)用較廣［18?20】。4CAP-trapper方法CAP-Trapper方法是由Carninci等提出的［4］,它是根據(jù)mRNA5,端及3’端存在一個(gè)共同二醇結(jié)構(gòu)來建庫。將這種二
6、醇結(jié)構(gòu)氧化后進(jìn)行生物素修飾，再經(jīng)過沉淀、酒精洗滌、無RNase的雙蒸水重新懸浮等篩選步驟，得到生物素化的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cD-NA第一鏈，接著進(jìn)行RNasel處理，未被cDNA保護(hù)的mRNA被降解。后經(jīng)青鏈霉素磁珠吸附并使用弱堿降解mRNA,得到單鏈全長(zhǎng)cDNA,在末端轉(zhuǎn)移酶的催化下進(jìn)行5’端01igo(G)加尾，再進(jìn)行第二鏈的合成，定向克隆即可得到全長(zhǎng)cDNA文庫。為了提高合成全長(zhǎng)cDNA的能力和測(cè)序效果，該方法進(jìn)行了改進(jìn)。一是用海藻糖、山梨糖醇熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。mRNA5’端二級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙反轉(zhuǎn)錄
7、的進(jìn)行，高溫破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)但同時(shí)也抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。海藻糖的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保證反轉(zhuǎn)錄酶的活性在55?60°C的高溫下正常發(fā)揮，有利于全長(zhǎng)cDNA的合成。二是用Ssth或Bsal、BamHlXhol雙酶切替換EcolTXhol雙酶切。EcolT對(duì)甲基化不敏感，容易將全長(zhǎng)cDNA近端的閃部已甲基化的識(shí)別位點(diǎn)切割。用對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Ssth或BsaT、Bamlll等替換Ecoll,提高了文庫全長(zhǎng)比例。三是用SSLM法加尾克服Oligo(G)加尾對(duì)測(cè)序的干擾［25］,雖然加尾效率(44%)
8、稍抵于Oligo(G)加尾(52%),但該法加尾對(duì)片段無選擇性，且加尾時(shí)無須使川MnC12和CoC12，不會(huì)造成全長(zhǎng)cDNA降解，還利于全長(zhǎng)cDNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)克?。?6'271。與其他方法相比，CAP-Trapper方法可以說是一種較好的構(gòu)建髙質(zhì)S:全長(zhǎng)文庫方法，它兼顧了文庫代表性好，全長(zhǎng)比例高，建庫效率高的優(yōu)點(diǎn)［13,28］。但也有些缺點(diǎn)(：l)mRNA長(zhǎng)期暴露在酶反應(yīng)體系中，有降解風(fēng)險(xiǎn)(；2)
