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1、植物源農(nóng)藥殺蟲(chóng)與抑制幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定論文周桂孫果宋，黃科林，林潤(rùn)國(guó)，張桂華，鄧光輝【摘要】目的研究青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟蟲(chóng)的毒殺作用以及對(duì)蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用。方法采用室內(nèi)藥液噴蟲(chóng)法測(cè)定3種植物乙醇提取物的殺蟲(chóng)活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果青蒿、桉樹(shù)、紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟24h的校正死亡率分別為(69.00±3.87)%，(53.47±11.63)%，(18.60±6.70)%。對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶的抑制率分別為(20.33±1.42)%，(20.59±1.72)%.freelangrov
2、eavicenniamarinaleavesethanolextractsontheinsecticidalactivityandchitinaseinhibitoryactivityagainstGalleriamellonella.MethodsTheinsecticidalactivityandchitinaseinhibitoryactivityofthethreeplantethanolextractsethod.ResultsTheresultsshoent,thecorrecteddeathratiosofsouthe
3、rnangroveavicenniamarinaleavesethanolextractangroveavicenniamarinaleavesethanolextractmarkedly.Keyellonella;Insecticidalactivity;Chitinase21世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)是更加注重農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全性,倡導(dǎo)安全優(yōu)質(zhì)綠色食品1，2，從天然植物中提取殺蟲(chóng)活性物質(zhì)防治農(nóng)林害蟲(chóng),已成為研究熱點(diǎn),并對(duì)現(xiàn)代農(nóng)藥研究具有重要意義。幾丁質(zhì)酶(chitinase)可以水解昆蟲(chóng)體壁和中腸中的幾丁質(zhì)，在昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育過(guò)程中
4、扮演重要角色。幾丁質(zhì)酶抑制劑通過(guò)抑制幾丁質(zhì)酶活性干擾昆蟲(chóng)正常變態(tài)發(fā)育過(guò)程而達(dá)到殺蟲(chóng)的目的。由于動(dòng)植物機(jī)體不含幾丁質(zhì)，故以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型生物農(nóng)藥具有安全無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)3，4。目前已篩選出近十種不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶抑制劑,包括糖類(lèi)與肽類(lèi)幾丁質(zhì)酶抑制劑4。而有關(guān)青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉來(lái)源的幾丁質(zhì)酶抑制劑未見(jiàn)報(bào)道。大蠟螟(Galleriamellonella)屬螟蛾科蠟螟亞科,.freell50%乙醇，超聲萃取20min，過(guò)濾，濾液減壓蒸餾，收集膏狀物并稱(chēng)重，用95%的乙醇溶解，配制成濃度為100mg/ml的植物提取物母液備用。
5、2.2殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)選擇蟲(chóng)齡與蟲(chóng)體大小基本一致的試蟲(chóng)20只，置于墊有中性濾紙的90mm保濕玻璃培養(yǎng)皿中,將植物提取物母液稀釋為1.5%的濃度(內(nèi)含1%的吐溫80)，作為供試藥液。采用小型噴霧器噴霧法對(duì)準(zhǔn)蟲(chóng)噴霧,每皿噴藥液約1ml。對(duì)照組用95%的乙醇代替供試藥液，將培養(yǎng)皿放置于26℃的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h(晝夜比16∶8)。24h后檢查死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率與校正死亡率。死亡率(%)=(死亡的蟲(chóng)子/蟲(chóng)子總數(shù))×100%，校正死亡率(%)=(死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)×100%。測(cè)定活蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活力，計(jì)算酶活抑制率。每處
6、理設(shè)3個(gè)重復(fù)。2.3蟲(chóng)體蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定大蠟螟蟲(chóng)勻漿液中蛋白質(zhì)含量6。2.4N-乙酰氨基葡萄糖還原糖的測(cè)定3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定6。2.5幾丁質(zhì)酶液的提取與活性測(cè)定取1g蟲(chóng)體，冰浴研磨勻漿,制成10%勻漿液，離心(3500r/min)20min取上清用于酶活的測(cè)定。取0.5ml上清液加入lml磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.6)，0.5ml1.5%膠體幾丁質(zhì)，于37℃水浴振蕩酶反應(yīng)30min，立即沸水浴10min終止酶反應(yīng)后離心(4000r/min)5min后取上清液0.5ml，采用DN
7、S法測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖還原糖的量。酶活力單位(U)以在上述反應(yīng)條件下,每1min產(chǎn)生1μmolN-乙酰氨基葡萄糖還原糖所需的酶量計(jì)算。酶比活力以單位蟲(chóng)體蛋白質(zhì)的酶活力表示。3結(jié)果與分析3.1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲(chóng)活性見(jiàn)表1。由表1可知，3種植物源農(nóng)藥提取物均表現(xiàn)出一定的殺蟲(chóng)活性。其中青蒿葉與桉樹(shù)葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟的校正死亡率較高，兩者之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。校正死亡率最低的為紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物，與青蒿葉、桉樹(shù)葉乙醇提取物相比差異達(dá)到顯著水平(P0.05)。表1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲(chóng)活性表中同列
8、數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示在P0.05水平上有顯著差異3.2大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.04131X–0.03356，R2=0.9992)求出大蠟螟蟲(chóng)勻漿液中蛋白質(zhì)含量為33.7ug/g鮮重。N-乙酰氨基葡萄糖
