導流雜交基因芯片技術在人乳頭瘤病毒基因分型的應用論文

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1、導流雜交基因芯片技術在人乳頭瘤病毒基因分型的應用論文【摘要】目的探討對人乳頭瘤病毒(HPV)感染進行準確快速基因診斷和分型的方法。方法采用導流雜交基因芯片技術和實時熒光PCR對75例疑似HPV感染的標本進行基因診斷和分型。結果基因芯片陽性28例,其中單一感染21例,多重感染7例；實時熒光PCR陽性25例。二者在陽性結果中有很好的一致性。結論導流雜交基因芯片技術適合臨床篩查HPV感染及對HPV進行基因分型。【關鍵詞】乳頭瘤病毒人基因型寡核苷酸序列分析原位雜交人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HP

2、V)是小分子雙鏈DNA病毒,具有強烈嗜上皮性,高度組織和宿主特異性,可致人類皮膚和黏膜異常增生,引起多種良、惡性病變。目前已經(jīng)鑒定100多種亞型,其中近40種能感染生殖器官。根據(jù)其對生殖系統(tǒng)的致癌性不同,可將其分為低危型和高危型12。前者包括HPV6,11,42,43等亞型,.freelL的加蓋微量離心管(1.5mL)中,采集的樣本在室溫放置2h,4℃保存＜24h,-20℃保存＜3個月,樣本避免反復凍融。1.1.2試劑及儀器HPVDNA抽提試劑盒(QIAMini試劑盒,德國QIAGEN公司),HPV基因分型檢測

3、試劑盒(中國凱普生物科技有限公司),可檢測21種HPV亞型,包括13種高危亞型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5種低危亞型(6,11,42,43和44型)和3種中國人群常見亞型(53,66和CP8304型)。另外在膜上還包括用于質(zhì)量控制的陰性對照點、內(nèi)對照點(用于監(jiān)測PCR反應)和Biotin對照點(用于監(jiān)測顯色系統(tǒng))；HPV6/11、16、和18型實時熒光PCR檢測試劑盒(深圳匹基生物有限公司)；擴增儀(PE9700，美國ABI公司)；熒光定量PCR儀(Lig

4、htCycler，瑞士Roche公司)；醫(yī)用核酸分子快速雜分儀（中國凱普公司）。1.2方法1.2.1標本DNA提取取上述液體0.5mL,13000r/min離心1min,棄上清液,利用QIAMini試劑盒提取DNA,具體操作步驟按試劑盒說明書。1.2.2HybrMax法檢測21種HPV亞型1.2.2.1標本DNA擴增將水、PCRMIX、Taq酶和DNA模板按要求混勻,反應體系為25μL。PCR反應條件為20℃10min,95℃預變性9min；95℃20s→55℃30s→72℃30s共40個循環(huán),72℃延伸5mi

5、n。1.2.2.2導流雜交將擴增后的PCR產(chǎn)物加熱變性后冰浴,同時將固定有核酸探針的膜固定在雜交儀上,進行預雜交。把PCR產(chǎn)物加到薄膜上,讓樣品流入膜內(nèi)進行導流雜交,清洗除去未結合的DNA,整個雜交過程保持在45℃。1.2.2.3芯片顯色及結果判讀用封阻液封閉膜,孵育5min,重復2次。排出封阻液后加入酶標液,25℃溫育3.5min。用沖洗緩沖液徹底沖洗膜,除去未結合的酶標液,后加入NBT/BCIP底物顯色3～5min。在顯色后1h內(nèi)分析結果。1.2.3實時熒光PCR測定HPV亞型按照試劑說明書對每份標本檢測HP

6、V6/11、16和18等4種亞型。1.3統(tǒng)計學處理2種方法檢測結果比較用秩和檢驗,P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。2結果2.1HybrMax法檢測所有膜上陰性對照結果均為陰性,內(nèi)對照點和Biotin對照點均為陽性。75例樣本共28例陽性,其中單一感染21例,復合感染7例。HPV單一感染時,在膜芯片上相應HPV亞型探針位點處可見一藍紫色斑點,雙重或多重感染時,在膜上可見兩個或兩個以上顯色斑點(圖1)。2.2熒光定量PCR檢測75例樣本共檢出25例陽性,其中單一HPV6/11亞型陽性15例,單一HPV16亞型陽性3例

7、,單一HPV18亞型陽性2例,HPV6/11和HPV16均陽性1例,HPV6/11和HPV18均陽性4例。2.3HybrMax法與熒光定量PCR比較75例標本HybrMax法28例陽性,熒光定量PCR25例陽性,經(jīng)統(tǒng)計分析顯示其差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),表明二者在陽性結果中有較好的一致性,但實時熒光PCR有一定的漏檢率,漏檢標本包括2例53亞型及58亞型的單一感染和1例35和58亞型的復合感染。另外4例復合型感染除了有常見的6，11，16，18亞型外,還檢出31，53,58,66及CP8304亞型(表1,

8、2)。在以上檢測到的亞型中33，58.freelanpapillomavirusinfection/J/.ClinInfectDis,2006,43(5):624629./2/TrottierH,FrancoEL.Theepidemiologyofgenitalhumanpapillomavirusinfection/J/.Vaccine,2006,24(Suppl1)