液相芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用的研究(7238)

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1、㈨IIIIIIIrlIlrIrlPIIIY1997279碩士學(xué)位論文液相芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用研究碩士研究生：彭春梅指導(dǎo)教師：陳曉光教授摘要目的和意義：宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)每年大約有50萬(wàn)左右的新發(fā)病例，我國(guó)的患病率及病死率約占世界的1／3，其死亡率居女性腫瘤的第2位，已成為危害女性身體健康的主要?dú)⑹种弧緇】。大量研究顯示，人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneopl

2、asia，C1N)的直接和主要病因。宮頸癌患者的HPV檢出率可達(dá)99．17％，其歸因危險(xiǎn)百分比達(dá)90％以上【1，3】。HPV有100多種亞型，其中與泌尿生殖道感染相關(guān)的有40余種。根據(jù)其對(duì)生殖系統(tǒng)的致癌性可分為低危型和高危型，前者主要引起尖銳濕疣等良性病變，后者常引起宮頸癌等惡性病變【2，91。由于HPV的致病性及致癌性與其亞型密切相關(guān)，不同亞型以及高危型及低危型感染所導(dǎo)致的結(jié)果截然不同，而且同一高危亞型持續(xù)感染是導(dǎo)致癌變的主要因素，所以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和分型對(duì)于臨床診斷、癌變預(yù)防與治療具有重要意義[41。液相芯片是基

3、于Luminex。M的一種多功能生物芯片的分析平臺(tái)，有機(jī)整合了編碼微球(color-codedmicrospHereorbead)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，使其具有高通量，高靈敏度，高速度等特劇51。理論上Luminex法可以對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)，而新開發(fā)的LuminexXMAP更能一次性檢測(cè)到500種目的分子，在35～60min內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè)，且靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣本即可進(jìn)行檢測(cè)，價(jià)格低廉，可以廣泛用于大規(guī)模流行病學(xué)的調(diào)查

4、、臨床樣中文摘要本的篩查、監(jiān)視治療干預(yù)和評(píng)價(jià)疫苗效果【5’6】。近年來(lái)，隨著液相芯片技術(shù)的日漸成熟，其在病原微生物的基因診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。研究?jī)?nèi)容：本研究利用LuminexTM技術(shù)平臺(tái)，選取與臨床感染密切相關(guān)的HPV23種高、低危型別(低危型包括HPV6，11，42，43，44等5種，高危型主要為HPVl6，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等18種)作為研究對(duì)象，選取23種型別的HPV樣本，經(jīng)測(cè)序及Blast驗(yàn)證為相應(yīng)型別，將各型別L

5、1區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組克隆構(gòu)建質(zhì)粒庫(kù)，作為陽(yáng)性參照標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)基因分型檢測(cè)系統(tǒng)，并對(duì)HPV通用引物和探針進(jìn)行了篩選，建立PCR反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系，對(duì)影響雜交反應(yīng)的因素進(jìn)行系統(tǒng)的分析，獲得最佳反應(yīng)條件。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果證明該方法可對(duì)HPV準(zhǔn)確分型。為確立陽(yáng)性診斷的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多次檢測(cè)結(jié)果確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及參考值。以構(gòu)建的HPV液相芯片基因分型系統(tǒng)對(duì)314例單一型和混合型臨床HPV感染樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以測(cè)序法作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Luminex法的準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為L(zhǎng)uminex法運(yùn)用于臨床

6、HPV基因分型檢測(cè)做可行性研究。研究方法：1．構(gòu)建23個(gè)型別的HPV-L1區(qū)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)：通過(guò)查找genbank中待檢測(cè)的23種型別的HPV序列，選擇Ll區(qū)的MY09／11引物擴(kuò)增區(qū)作為目標(biāo)序列。用HPV-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床收集的樣本進(jìn)行HPV檢測(cè)，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)為23種待檢測(cè)的型別。將每種型別的MY09／11引物擴(kuò)增區(qū)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、重組克隆。對(duì)克隆質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序再鑒定，檢索GenBank，確認(rèn)為相應(yīng)型別。保存HPV6，11，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，

7、53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等23種型別的陽(yáng)性克隆。作為HPV分型的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)。2．HPV基因分型液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)的建立：PCR體系的建立：針對(duì)23種型別HPV的目標(biāo)檢測(cè)序列，采用通用型引物Il碩士學(xué)位論文MY09／Il用于擴(kuò)增HPVL1區(qū)的高保守區(qū)，同時(shí)設(shè)計(jì)一條引物P8用于擴(kuò)增部分通用引物不能兼顧的型別。擴(kuò)增產(chǎn)物為450bp。內(nèi)參引物PCOI／02用于擴(kuò)增人13-Globin基因，對(duì)樣本提取及PCR過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，產(chǎn)物大小為221bp。目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域及內(nèi)參片段的上游引物采用生物素標(biāo)記

8、，以便于液相芯片雜交檢測(cè)。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及樣本的擴(kuò)增對(duì)PCR體系各組份以及PCR程序進(jìn)行優(yōu)化獲得最佳擴(kuò)增條件。雜交體系的建立：根據(jù)HPV-LI區(qū)基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)23種HPV型別的特異性探針；同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)內(nèi)參13-Globin片段的質(zhì)控探針，對(duì)HPV分型檢測(cè)系統(tǒng)的樣本提取及PCR過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。探針5’端以氨基修飾，25條探針按照LuminexTM平臺(tái)技