人乳頭瘤病毒基因分型液態(tài)芯片的構建

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1、人乳頭瘤病毒基因分型液態(tài)芯片的構建【摘要】目的:通過構建人乳頭瘤病毒基因分型的液態(tài)芯片,建立高通量、靈敏和特異的HPV型別檢測系統(tǒng)。方法:在LuminexTM平臺上,采用國際公認的標準HPV質(zhì)粒建立13種基因分型HPV芯片,選擇引物及探針,將探針有效的偶聯(lián)到微球上。結(jié)果:用LuminexTM平臺建立了13型HPV芯片,對單一或兩種標準質(zhì)?；旌系臉悠肪蓽蚀_分型。對分型檢測的陽性標本進行基因測序,經(jīng)美國NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對符合其檢測型別。結(jié)論:利用LuminexTM平臺構建了13種HPV型別液相芯片的診斷體系,具有高通量、快速準確等特點,適用于大規(guī)模臨床樣本的HPV基因分型的診斷

2、。【關鍵詞】人乳頭瘤病毒（HPV）基因分型芯片　　人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）基因分型,對臨床HPV感染疾病的診斷與治療具有重要的意義。目前采用的PCR檢測技術假陽性率較高、Southernblot或反向雜交方法進行操作繁瑣,一次檢測樣本量有限,限制了其大規(guī)模篩查中的需要。我們擬利用LuminexTM平臺系統(tǒng)［1-3］,構建人乳頭瘤病毒基因分型的液態(tài)芯片,建立特異性強、高通量、高靈敏度的HPV型別檢測系統(tǒng)?！　?材料和方法　　1.1材料　　HPV31、HPV35、HPV56全基因序列質(zhì)粒,由美國ResearchandDevelopmentDigeneC

3、orporationAttilaLrincz教授惠贈;HPV58全基因序列質(zhì)粒由日本ToshihikoMatsukura教授惠贈;HPV45、HPV51、HPV53全基因序列質(zhì)粒,由德國HeidelbergE.M.deVilliers教授惠贈;HPV6、HPV11、HPV16、HPV18含HPVL1區(qū)質(zhì)粒的菌懸液,由第四軍醫(yī)大學皮膚科惠贈。fluorescencelabeledpolystyrenebeads（Luminexmicrosphere熒光聚苯乙烯球,直徑為5600nm,帶有功能性羧基,密度1.25×109/L）購自Luminex公司?！　MAC(temtrameih

4、ylammdniumchloride)Lot043k82108、MES(2［NMorpholino］ethanesulfonicacid)(C6H13NO4SFolecularProbesLot:83C21?！　?.2方法　　1.2.1引物及探針　　根據(jù)LuminexTM平臺系統(tǒng)的要求,選擇GP5+/GP6+系統(tǒng),采用deRodaHusman［4］設計。所有選擇的探針參考M.V.JACOBS［5］,通過使用美國NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對研究。　　1.2.2HPV感染類型　　選擇占外生殖器部位HPV感染類型的96%左右的HPV低危類型HPV6、HPV11和HPV53及高危類型

5、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58等為構建液態(tài)芯片的首批HPV型別?！　?.2.3探針偶聯(lián)及偶聯(lián)效率的檢測　　通過寡核苷酸5′氨基與微球表面的羧基在偶聯(lián)反應液中偶聯(lián),微球表面的羧基點通過MES和EDC而激活,為了減少蛋白在寡核苷酸與微球雜交中的相互干擾現(xiàn)象,探針設計時通過加上帶生物素酶的碳臂,而有效的結(jié)合在微球表面。為了檢測探針是否已連接到微球上,設計偶聯(lián)探針的互補探針,在互補探針序列5′端加Biotin修飾。　　1.2.4微球雜交　　將帶有C14臂探針的微球與待測的PCR產(chǎn)物按比例在終濃

6、度為3mol/L的TMAC反應液中混合,通過核酸解連、雜交反應和SAPE染色后,通過Luminex100儀器（BIARAD技術平臺）檢測?！　?.2.5陽性質(zhì)粒微球探針熒光值標準曲線的建立　　陽性質(zhì)粒抽提后,以此為模板進行PCR擴增,將擴增后PCR產(chǎn)物進行濃度梯度稀釋,各稀釋產(chǎn)物分別與帶有各型HPV探針的微球進行雜交、染色,最后進行LuminexTM100儀器BioPlex系統(tǒng)檢測,根據(jù)BioPlex管理軟件分析采用TheLogistic5PL計算標準曲線。　　1.2.6統(tǒng)計學處理　　使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析,對陽性質(zhì)粒標準的檢測數(shù)據(jù),采用判別分析法,對結(jié)

7、果進行方差分析,建立判別函數(shù)。　　2結(jié)果　　2.1陽性質(zhì)粒抽提及PCR檢測　　各型質(zhì)粒經(jīng)過重新抽提后,檢測結(jié)果見圖1?！　?.2陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物與微球探針的雜交反應結(jié)果　　2.2.1單一PCR的雜交反應　　用13種帶有不同編號的微球分別與HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、和HPV58型探針偶聯(lián)后,使13種微球分別帶有不同的探針。將這13