導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型的應(yīng)用

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1、導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型的應(yīng)用2結(jié)果2.1HybrMax法檢測(cè)所有膜上陰性對(duì)照結(jié)果均為陰性,內(nèi)對(duì)照點(diǎn)和Biotin對(duì)照點(diǎn)均為陽(yáng)性。75例樣本共28例陽(yáng)性,其中單一感染21例,復(fù)合感染7例。HPV單一感染時(shí),在膜芯片上相應(yīng)HPV亞型探針位點(diǎn)處可見(jiàn)一藍(lán)紫色斑點(diǎn),雙重或多重感染時(shí),在膜上可見(jiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上顯色斑點(diǎn)(圖1)。2.2熒光定量PCR檢測(cè)75例樣本共檢出25例陽(yáng)性,其中單一HPV6/11亞型陽(yáng)性15例,單一HPV16亞型陽(yáng)性3例,單一HPV18亞型陽(yáng)性2例,HPV6/11和HPV16均陽(yáng)性1例,HPV6/11和HPV18均陽(yáng)性4例。2.3HybrMax法與

2、熒光定量PCR比較75例標(biāo)本HybrMax法28例陽(yáng)性,熒光定量PCR25例陽(yáng)性,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),表明二者在陽(yáng)性結(jié)果中有較好的一致性,但實(shí)時(shí)熒光PCR有一定的漏檢率,漏檢標(biāo)本包括2例53亞型及58亞型的單一感染和1例35和58亞型的復(fù)合感染。另外4例復(fù)合型感染除了有常見(jiàn)的6，11，16，18亞型外,還檢出31，53,58,66及CP8304亞型(表1,2)。在以上檢測(cè)到的亞型中33，58，66亞型都為HPV的高危亞型,說(shuō)明HybrMax法在檢測(cè)HPV復(fù)合感染以及高危型HPV檢出方面具有優(yōu)勢(shì)。3討論宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,臨床證明95.

3、0％～99.7％宮頸癌和高危型HPV感染有關(guān)[3]。而且不同亞型HPV對(duì)子宮頸癌致癌性有不同影響,因此,準(zhǔn)確診斷HPV感染及其分型對(duì)宮頸癌篩查、早期確診及治療效果監(jiān)測(cè)有著重大意義。HPV分型檢測(cè)研究一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[4]。目前,對(duì)HPV感染的分型診斷主要方法有斑點(diǎn)雜交、Southern印跡及實(shí)時(shí)熒光PCR等。傳統(tǒng)的斑點(diǎn)雜交、Southern印跡由于雜交過(guò)程操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)(雜交需十幾個(gè)小時(shí)甚至1d),檢測(cè)低拷貝基因的敏感性不足,可能需要使用同位素等,表1基因芯片結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果的比較:由于匹基實(shí)時(shí)熒光PCR的試劑不能對(duì)HPV6和11兩種亞型分別進(jìn)行檢測(cè),因

4、此,當(dāng)患者感染其中任何一種亞型時(shí),其檢測(cè)結(jié)果表示為HPV6/11亞型陽(yáng)性.表2熒光定量PCR和基因芯片結(jié)果的χ2檢驗(yàn)不適合臨床常規(guī)檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)HPVDNA已經(jīng)應(yīng)用于臨床,其靈敏度和可靠性已得到認(rèn)可,但目前能檢測(cè)的HPV亞型十分有限,主要包括常見(jiàn)的HPV6,11,16,18四種亞型[5],易漏診其他HPV亞型的感染,不利于流行病學(xué)和病因?qū)W的進(jìn)一步深入研究?；蛐酒墙陙?lái)發(fā)展起來(lái)的可對(duì)病原體核酸進(jìn)行高通量快速檢測(cè)的技術(shù)[6]。HybrMax法是導(dǎo)流雜交技術(shù)結(jié)合低密度基因芯片技術(shù),利用PCR擴(kuò)增提高檢測(cè)的靈敏度,分子雜交特異性高,是HPV基因型分型檢測(cè)的新方法[7]。

5、運(yùn)用其高通量檢測(cè)的特點(diǎn),達(dá)到對(duì)21種常見(jiàn)高危型和低危型HPV亞型在同一樣品中進(jìn)行分型檢測(cè)。與現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光PCR相比,具有很多優(yōu)點(diǎn):(1)利用芯片高通量的特點(diǎn)可一次性檢測(cè)21種亞型,增加了HPV感染的檢出率及不同亞型復(fù)合感染的檢測(cè)率[3],尤其是高危型的檢出；(2)芯片設(shè)計(jì)考慮了中國(guó)人感染HPV的特點(diǎn),包含了中國(guó)人常見(jiàn)的3個(gè)亞型(53，66和CP8304亞型),有利于在我國(guó)篩查HPV感染；(3)有良好的質(zhì)量控制體系。基因芯片上包括了陰性對(duì)照點(diǎn)、內(nèi)對(duì)照點(diǎn)和biotin對(duì)照點(diǎn),對(duì)基因擴(kuò)增和雜交實(shí)行了全程控制；(4)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需3.5h就可出具檢驗(yàn)報(bào)告,檢測(cè)時(shí)間短,能滿足臨床需

6、要；(5)結(jié)果可靠。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果對(duì)比,說(shuō)明HybrMax法的檢測(cè)結(jié)果具有與熒光定量PCR相當(dāng)?shù)撵`敏度和可靠性。本研究中,HybrMax法共檢出10種HPV基因型,其中高危型的檢出率為18.7％,混合型9.3％；而實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢出高危型13.3％,混合型6.7％。HybrMax法檢出的高危型別包括HPV16，18，31，35，53，58，66型,其中HPV16，18型與泌尿生殖道腫瘤關(guān)系密切,尤其是宮頸癌。所以對(duì)尖銳濕疣患者進(jìn)行HPVDNA的基因分型,對(duì)于判定預(yù)后,指導(dǎo)臨床對(duì)高危型及多重型HPV感染患者長(zhǎng)期隨訪,采取針對(duì)治療措施,降低與HPV相關(guān)腫瘤的

7、發(fā)生率有重要意義。HybrMax法檢測(cè)HPV亞型包含了PCR技術(shù)的高敏感性、導(dǎo)流雜交技術(shù)的快速性和基因芯片的高通量性,是一種適合目前臨床篩查HPV感染同時(shí)對(duì)HPV進(jìn)行基因分型的有效方法。雖然目前基因芯片技術(shù)成本昂貴,檢測(cè)的可靠性、實(shí)用性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證,但基因芯片技術(shù)用于HPV的分型檢測(cè)有廣闊的前景?！緟⒖?/p>