液相芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型檢測中的應(yīng)用的研究

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1、中文摘要本的篩查、監(jiān)視治療干預(yù)和評價疫苗效果【5’6】。近年來，隨著液相芯片技術(shù)的日漸成熟，其在病原微生物的基因診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。研究內(nèi)容：本研究利用LuminexTM技術(shù)平臺，選取與臨床感染密切相關(guān)的HPV23種高、低危型別(低危型包括HPV6，11，42，43，44等5種，高危型主要為HPVl6，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等18種)作為研究對象，選取23種型別的HPV樣本，經(jīng)測序及Blast驗證為相應(yīng)型別，將各型別L1區(qū)PCR產(chǎn)物進行重組克隆構(gòu)建質(zhì)粒庫，作為陽性參照標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計基因分型檢測系

2、統(tǒng)，并對HPV通用引物和探針進行了篩選，建立PCR反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系，對影響雜交反應(yīng)的因素進行系統(tǒng)的分析，獲得最佳反應(yīng)條件。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果證明該方法可對HPV準(zhǔn)確分型。為確立陽性診斷的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義的多次檢測結(jié)果確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及參考值。以構(gòu)建的HPV液相芯片基因分型系統(tǒng)對314例單一型和混合型臨床HPV感染樣本進行檢測，同時以測序法作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，對Luminex法的準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度進行評價，為Luminex法運用于臨床HPV基因分型檢測做可行性研究。研究方法：1．構(gòu)建23個型別的HPV-L1區(qū)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品庫：通過查找genbank中待檢測的23種型別的HPV

3、序列，選擇Ll區(qū)的MY09／11引物擴增區(qū)作為目標(biāo)序列。用HPV-PCR檢測試劑盒對臨床收集的樣本進行HPV檢測，對結(jié)果陽性者進行測序確認(rèn)為23種待檢測的型別。將每種型別的MY09／11引物擴增區(qū)的PCR產(chǎn)物進行純化、重組克隆。對克隆質(zhì)粒經(jīng)測序再鑒定，檢索GenBank，確認(rèn)為相應(yīng)型別。保存HPV6，11，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304等23種型別的陽性克隆。作為HPV分型的陽性標(biāo)準(zhǔn)品庫。2．HPV基因分型液相芯片檢測系統(tǒng)的建立：PCR體系的建立：針對23種型別HPV的目標(biāo)檢測序

4、列，采用通用型引物Il碩士學(xué)位論文MY09／Il用于擴增HPVL1區(qū)的高保守區(qū)，同時設(shè)計一條引物P8用于擴增部分通用引物不能兼顧的型別。擴增產(chǎn)物為450bp。內(nèi)參引物PCOI／02用于擴增人13-Globin基因，對樣本提取及PCR過程進行質(zhì)控，產(chǎn)物大小為221bp。目標(biāo)擴增區(qū)域及內(nèi)參片段的上游引物采用生物素標(biāo)記，以便于液相芯片雜交檢測。通過對陽性標(biāo)準(zhǔn)品及樣本的擴增對PCR體系各組份以及PCR程序進行優(yōu)化獲得最佳擴增條件。雜交體系的建立：根據(jù)HPV-LI區(qū)基因序列特點，設(shè)計針對23種HPV型別的特異性探針；同時設(shè)計針對內(nèi)參13-Globin片段的質(zhì)控探針，對HPV分型檢測系統(tǒng)的樣

5、本提取及PCR過程進行質(zhì)控。探針5’端以氨基修飾，25條探針按照LuminexTM平臺技術(shù)方案分別偶聯(lián)至特定編碼的羧基微球上，制備成HPV分型檢測的液相芯片。通過與陽性標(biāo)準(zhǔn)品的PCR產(chǎn)物進行雜交并以LuminexXM200進行檢測，對雜交體系的各組份及雜交溫度(45℃、50。C、55。C、58。C)進行優(yōu)化。通過對多型標(biāo)準(zhǔn)品PCR產(chǎn)物的等比及不等比混合樣品的檢測，確定HPV基因分型液相芯片檢測系統(tǒng)對臨床混合型標(biāo)本的檢測性能；通過對同一標(biāo)準(zhǔn)品的5次檢測，確定檢測系統(tǒng)的重復(fù)性。3．參考值確定及質(zhì)控體系建立．根據(jù)陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果，確定判別檢測結(jié)果的參考值，并以感染率最高的HPVl6型

6、作為檢測系統(tǒng)的陽性質(zhì)控品。檢測體系中的陽性內(nèi)參探針(PC)對樣本提取及PCR體系進行質(zhì)控，顯色內(nèi)參探針(CC)對微球偶聯(lián)效率及雜交后顯色過程進行質(zhì)控。4．大樣本檢測對所建立液相芯片檢測系統(tǒng)的性能評價：收集314例臨床樣本，為女性生殖道疾病患者及健康體檢者的尿道分泌物、宮頸脫落細(xì)胞或疣體細(xì)胞保存液。用煮沸法提取樣本DNA備用。以測序法作為驗證標(biāo)準(zhǔn)，采用所建立的Luminex法對314例HPV樣本進行基因分型檢測，同時所有樣本以測序法進行驗證。以測序法作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，通過統(tǒng)計學(xué)方法計算，對Luminex法用于HPV分型檢測的靈敏度，特異性，準(zhǔn)確度等指標(biāo)進行評價。III中文摘要結(jié)果：1．

7、對臨床23種型別的HPV陽性樣本進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物重組克隆，經(jīng)測序驗證，構(gòu)建了HPV6，1l，42，43，44，16，18，3l，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304的陽性標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)粒)。2．本研究建立的液相芯片系統(tǒng)，通過對構(gòu)建的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，確定了PCR引物序列，以及PCR體系中各引物、DNA聚合酶、M92+、dNTPs等各組份的濃度和比例，并確定了PCR最適反應(yīng)程序。在確定的體系中，HPV擴增區(qū)及內(nèi)參片