合浦珠母貝c型凝集素基因及其snp位點(diǎn)分析

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1、/.'上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對(duì)●所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。}i≥學(xué)位論文作者簽名：棚鋸藪爵同期：a2川年匆月I2／F{上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，◆同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論

2、文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在年解密后適用本版權(quán)書。指導(dǎo)教師簽名：，肜本學(xué)位論文屬于不保密∥●學(xué)位論文作者簽名：鑰鈮破舀∥¨期：刃l(wèi)J年6月I易同只期：們，年石月、'??上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單姓名工作單位職稱備注●轂‘上晦i毛強(qiáng)欠譬彳i毒毛主席硼鉚許占弗菘愛委員參l霞杉饞向枷犬溽袤磺委員委員委員委員委員●秘書答辯地點(diǎn)南海水產(chǎn)研究所答辯日期2011

3、．6．12●????上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文合浦珠母貝C-型凝集素基因及其SNP位點(diǎn)研究摘要■合浦珠母貝(Pincatadafucata)又稱馬氏珠母貝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低緯度海區(qū)，在我國(guó)主要分布于廣東、廣西和海南等沿海地區(qū)，是我國(guó)生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類之一，其生產(chǎn)的珍珠具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究在合浦珠母貝cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序的基礎(chǔ)上，經(jīng)過EST序列比對(duì)，獲得2個(gè)合浦珠母貝C一型凝集素(C-typelectin)基因，分別命名為PoLECI和PoLEC2，分析了PoLECl和PoLEC2的序列特

4、征和組織表達(dá)調(diào)控模式，對(duì)PoLECI進(jìn)行了原核重組表達(dá)及功能分析，證實(shí)了其具有凝集細(xì)菌的活性，同時(shí)，克隆了PoLECI基因組，經(jīng)分析和篩選，獲得了30個(gè)SNP位點(diǎn)，分析其與露空脅迫抗性的相關(guān)性，證實(shí)了PoCL-S18和PoCL-S26位點(diǎn)與抗露空脅迫顯著相關(guān)，為合浦珠母貝分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。1．PoLECl的序列、表達(dá)和功能分析PoLECI全長(zhǎng)998bp，5’-UTR為33bp，3’-UTR為101bp，開放閱讀框?yàn)?61bp，●編碼287個(gè)氨基酸，分子量為31．68kDa，理論等電點(diǎn)約5．83。預(yù)測(cè)的氨基酸

5、序列中含有信號(hào)肽(Met’-Serl9)和糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域中存在6個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)。同源性分析結(jié)果表明，PoLECl與其它物種c一型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域序列同源性在16．曠27．3％之間，相似性在28．9—48．5％之間。進(jìn)化分析結(jié)果表明，PoLECl與櫛孔扇貝聚為一支，與無(wú)脊椎動(dòng)物親緣較近。組織表達(dá)模式分析表明PoLECImRNA在肝胰腺，外套膜、性腺、閉殼肌、腸、鰓和血淋巴組織均有表達(dá)，在肝胰腺中的表達(dá)量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后，PoLEClmRNA在肝胰腺中的表達(dá)分析結(jié)果表明，在刺激后2

6、h表達(dá)顯著下調(diào)，而在4h和24h表達(dá)顯著上調(diào)。利用PoLECI成熟肽序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，用HisBind樹脂純化得到PoLECI重組蛋白，細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)大腸桿菌和芽孢桿菌有明顯的凝集作用?！?．PoLEC"2的序列分析和組織表達(dá)分析PoLEC2全長(zhǎng)為1659bp，5’-UTR為39bp，3'-UTR為45bp，開放閱讀框?yàn)?575bp，可編碼525個(gè)氨基酸，分子量約58．03kDa，理論等電點(diǎn)為5．22。PoLEC2氨基酸含有信號(hào)肽序列(M1_A16)、一個(gè)MAId-2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)c

7、_型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域。同源性分析結(jié)果表明，PoLEC2與其它物種C一型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域序列的同源性在26．5-33．6％之間，相似性在45．1-55．6％之間。進(jìn)化分析結(jié)果表明，合浦珠母????上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文貝與貽貝在進(jìn)化樹同一個(gè)分支上。組織表達(dá)模式分析表明PoLEC2mRNA在肝胰腺、外套膜、性腺、閉殼肌、腸和鰓組織均有表達(dá)，且在肝胰腺·}J的表達(dá)量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后24h，PoLEC2mRNA在肝胰腺中的表達(dá)顯著上調(diào)；刺激后8h在腸中的表達(dá)量顯著上調(diào)。■}3．PoLECl基因組的SNP分析在

8、PoLECl的cDNA序列中設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行基因組擴(kuò)增，成功地獲得了基因組序列，全長(zhǎng)4943bp，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)都符合典型的GT／AG法則。同時(shí)，通過對(duì)基因組DNA的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得30個(gè)SNP位點(diǎn)，其中13個(gè)是內(nèi)含子SNP，17個(gè)是外顯子SNP，有13個(gè)cSNP是錯(cuò)義SNP引起氨基酸的變化。這些SNP位