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1、第33卷第2期華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報Vol.33No.22014年3月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityMar.2014,28~33利用細(xì)菌雙雜交文庫篩選華癸中慢生根瘤菌7653R中與外膜蛋白Opa22互作的蛋白李一星李芳周鑫蘭謝福莉李友國華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室,武漢430070摘要為研究華癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R外膜蛋白Opa22在共生固氮過程中的作用機制,構(gòu)建了細(xì)菌雙雜交基因組隨機文庫,并以O(shè)pa22為誘餌,釣取與其相互作用的候選靶蛋白。結(jié)果獲得12個與Opa22蛋白互作的
2、陽性克隆,為后續(xù)研究Opa22的作用機制提供了新的線索和思路,同時也為開展根瘤菌蛋白互作的研究構(gòu)筑了良好的技術(shù)平臺。關(guān)鍵詞華癸中慢生根瘤菌7653R;細(xì)菌雙雜交文庫;共生固氮;Opa22;互作蛋白中圖分類號S154.38+1文獻標(biāo)識碼A文章編號1000-2421(2014)02-0028-06根瘤菌和豆科植物的共生固氮是一個多基因參及相關(guān)近緣細(xì)菌中。結(jié)構(gòu)域分析表明Opa22蛋白與的復(fù)雜過程,涉及到多種細(xì)胞信號傳遞途徑及多屬于外膜蛋白,具有β-barrel結(jié)構(gòu)域,與不透明蛋白[1-2]個蛋白的相互作用。隨著愈來愈多根瘤菌基因及相關(guān)的表面抗原COG3637、表面抗原2家族以及[
3、8]組測序的完成,更多的學(xué)者開始致力于共生固氮中外膜蛋白OmpW家族具有較高同源性。這3個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的研究,以期從蛋白互作的角度進一家族在許多動植物的病原菌中均存在,COG3637家[9]步完善對根瘤菌共生固氮分子機理的認(rèn)識。細(xì)菌雙族參與細(xì)菌與宿主的相互識別、附著和侵染;表面雜交系統(tǒng)是一種在細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)互作的有效方抗原2家族可保護病原菌免受宿主免疫反應(yīng)的傷[10]法,與酵母雙雜交系統(tǒng)相比,它具有如下一些優(yōu)點:害,引起免疫逃逸;而OmpW家族可保護細(xì)菌,大腸桿菌比酵母菌生長繁殖快、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳操抵抗抗生素等不良因素的脅迫,免受宿主細(xì)胞的吞[11-12]作方便,可進行
4、快速高通量的研究;檢測靈敏度高,噬。前期研究表明opa22的突變株不能在紫[3]降低了假陽性和假陰性的發(fā)生率;適用范圍廣,可云英根部結(jié)瘤,干擾了侵入線的形成。因此推測,[4]用于研究膜蛋白的相互作用等。因此細(xì)菌雙雜交Opa22可能參與根瘤菌與宿主之間的相互識別,在系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)的研究,目前該系侵染過程中發(fā)揮作用。為了研究該蛋白在共生固氮[5]統(tǒng)也已被應(yīng)用于固氮領(lǐng)域的研究。如廖貢獻等利過程中的作用機制,本研究構(gòu)建了華癸中慢生根瘤用大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)研究了陰溝腸桿菌固氮調(diào)節(jié)菌7653R細(xì)菌雙雜交基因組隨機文庫,旨在篩選與[6]蛋白NifL和NifA的相互作用;王應(yīng)
5、祥等建立了Opa22互作的候選靶蛋白,為后續(xù)的深入研究提供大豆根系細(xì)菌雙雜交的cDNA文庫,從中釣取并獲新的線索、思路和材料。得與GmWNK1互作的蛋白。1材料與方法華癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R可以與豆科植物紫云英共生固氮。前期工作1.1材料中我們利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫,從該菌中分報告菌株大腸桿菌EscherichiacoliXL1-Blue、離克隆到一個與早期結(jié)瘤相關(guān)的新基因opa22,它細(xì)菌雙雜交載體pBT和pTRG均購自Stratagene[7]編碼一個含有257個氨基酸殘基的蛋白。Blastn公司;華癸中慢生根瘤菌76
6、53R(M.huakuii分析發(fā)現(xiàn)opa22同源基因存在于多個種屬根瘤菌7653R)、大腸桿菌DH5α和DH10B均為華中農(nóng)業(yè)收稿日期:2013-10-17基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(31371549)、國家“973”計劃項目(2010CB126502)和博士點基金項目(20110146110012)李一星,博士,講師.研究方向:根瘤菌共生固氮的分子機理.E-mail:liyixing39@mail.hzau.edu.cn通信作者:李友國,博士,教授.研究方向:生物固氮、農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物.E-mail:youguoli@mail.hzau.edu.cn第2期李一星等:利用
7、細(xì)菌雙雜交文庫篩選華癸中慢生根瘤菌7653R中與外膜蛋白Opa22互作的蛋白29大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室生物固氮研究室CCGCCATAA-3′。按照100μL/管分別從80個甘保存。ExTaq酶、T4連接酶(Fermentas)、各種限油管中吸取菌液,加入200mLLB+Tet液體培養(yǎng)制性內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品;AlkalinePhos-基中,30℃振蕩培養(yǎng)過夜,次日收集菌體并抽提文phatase,Calfintestine(CIAP)購自Promega公司;庫轉(zhuǎn)化子的混合質(zhì)粒,作為華癸中慢生根瘤
