熱—酵母雙雜交.doc

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1、酵母雙雜交??酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立i。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄?；驹怼　《€結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表

2、達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含DNA-activatingdomain的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時，測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達，其表達產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence)，而GAL4-ad沒有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147);LexA(Ecoli轉(zhuǎn)錄抑

3、制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等?！　‰p雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)

4、構(gòu)域(如GAL4-ad，VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報道基因表達(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結(jié)合作用?！　〗湍鸽p雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強，后者又與啟動子DNA結(jié)合，此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。④通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使

5、信號放大。同時，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。結(jié)構(gòu)組成酵母雙雜交系統(tǒng)可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測定了多種重要結(jié)構(gòu)域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結(jié)構(gòu)域v，p21cip1蛋白與增殖細胞核抗原(proliferating-cellnuclearantigen，PCNA)的結(jié)合序列vi等。此外酵母雙雜交系統(tǒng)還應(yīng)用于闡明蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，繪制蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜，在藥物設(shè)計等許多方面。特點與優(yōu)點　　酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。

6、酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點:⑴作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。⑵檢測在活細胞內(nèi)進行，可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。⑶檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。局限性和存在的問題　　酵母雙雜交系統(tǒng)是分

7、析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作