小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究

《小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究Studiesoninsulin-producingcellsinducedfrommouseadiposetissue-derivedmesenchymalstemcells作者姓名：趙天闖專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：動(dòng)物學(xué)指導(dǎo)教師：李子義教授學(xué)位類(lèi)別：理學(xué)碩士論文答辯日期：2015年6月5日授予學(xué)位日期：2015年6月5日本研究得到國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2009CB941001，2011CBA01003）和教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1248）的資助ThisworkwassupportedbygrantsfromtheNati

2、onalBasicResearchProgram（973Program，No.2009CB941001and2011CBA01003）andProgramforChangjiangScholarsandInnovativeResearchTeaminUniversity(IRT1248)前言糖尿病是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重代謝性疾病。I型糖尿病是由于分泌胰島素的胰β細(xì)胞自身免疫性破壞，胰島素分泌量嚴(yán)重缺乏而引起的；II型糖尿病是由于胰[1]β細(xì)胞對(duì)糖的敏感性降低，導(dǎo)致胰島素分泌量缺乏而引起的。因此，在過(guò)去30[2]年中，胰島細(xì)胞移植被認(rèn)為是很有潛力的糖尿病治療方法。然而，這種治療方法由于胰腺供體

3、缺乏、胰島免疫排斥等因素而受到極大限制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)誘導(dǎo)或基因工程的方法使非胰β細(xì)胞系具有胰島素分泌功能，從而代替[3]胰β細(xì)胞用于糖尿病的細(xì)胞治療。干細(xì)胞具有維持自我更新的能力，并可在特定條件下分化為多種組織器官，因此干細(xì)胞療法被廣泛應(yīng)用于糖尿病治療中。研究表明，多種干細(xì)胞都可以分化[4]為胰島素分泌細(xì)胞，如：胚胎干細(xì)胞（EmbryonicStemCells,ESCs）、誘導(dǎo)多[5][6]能干細(xì)胞（InducedPluripotentStemCells,iPSCs）、成體干細(xì)胞等。ESCs雖然具有分化潛能，但卻受免疫排斥、致瘤性及倫理問(wèn)題的制約；iPSCs雖然可以通過(guò)特定

4、因子誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，但致瘤性仍然存在；成體干細(xì)胞則有效避免了以上問(wèn)題，并可從多種成體組織中取材，如：皮膚、唾液腺、肝、脾、骨髓、脂肪組織等。其中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AdiposeTissue-derivedMesenchymalStemCells,ADSCs）取材廣泛且不存在倫理問(wèn)題，可在體內(nèi)、外分化為內(nèi)胚層和[7,8]中胚層結(jié)構(gòu)，因此ADSCs是干細(xì)胞臨床應(yīng)用的極好細(xì)胞來(lái)源。轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的特殊區(qū)域結(jié)合，激活特異性基因表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物過(guò)程起調(diào)控作用。Pdx1可以調(diào)控多種胰β細(xì)胞基因，[9]在胰腺發(fā)育、胰β細(xì)胞分化及正常功能維持方面發(fā)揮關(guān)鍵作用

5、。NeuroD蛋白是B類(lèi)堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）基因家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，是非洲爪蟾的神經(jīng)源性因子，負(fù)責(zé)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄激活，對(duì)胰島素分泌細(xì)胞、胰高血糖素分泌細(xì)胞[10]等胰島細(xì)胞的終末分化起重要作用。MafA在小鼠胚齡13.5天左右開(kāi)始表達(dá)，并在胰β細(xì)胞成熟過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，直到小鼠成年，對(duì)胰β細(xì)胞的成熟、功能維[11]持和存活起重要作用。本實(shí)驗(yàn)選取了胰β細(xì)胞分化、成熟及功能維持的重要調(diào)控基因Pdx1、MafA、INeuroD1，分別構(gòu)建了三種基因的慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并將其以不同組合方式轉(zhuǎn)入小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（mouseadiposetissue-derivedmesenchymal

6、stemcells,mADSCs）進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三種因子聯(lián)合誘導(dǎo)分化，所得到的胰島素分泌細(xì)胞（InsulinProducingCells,IPCs）效率最高，并可在體外高糖刺激條件下，有效發(fā)揮糖分解作用。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找一種安全高效的胰島素分泌細(xì)胞，以替代受損的胰β細(xì)胞，為糖尿病臨床治療提供新的細(xì)胞材料和治療手段。II中文摘要小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究胰β細(xì)胞移植是目前治療糖尿病的最有效方法，然而這種療法需要大量的供體細(xì)胞，因此在取材上存在一定難度。另一種有效的治療方法是利用與胰β細(xì)胞同源的胰腺干細(xì)胞，將其增殖分化為胰β細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有

7、分化為多[12,13][14]種細(xì)胞類(lèi)型的分化潛能，且對(duì)宿主細(xì)胞具有免疫逃避特性，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞做為誘導(dǎo)分化的細(xì)胞材料。本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了Pdx1（胰十二指腸同源盒基因1）、MafA（V-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A）、NeuroD1（神經(jīng)分化因子1）三種基因的慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并分別將其轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。之后將所得慢病毒顆粒進(jìn)行濃縮，并分別以單因子侵染、雙因子侵染、三因子聯(lián)合侵染的方式對(duì)mADSC