酵母雙雜交實(shí)驗(yàn) 教案.pdf

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1、酵母雙雜交（YeastTwo-Hybrid）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆战湍鸽p雜交原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母雙雜交系統(tǒng)的原理是利用轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain,DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain,AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的這一特性，將BD與已知的誘餌蛋白質(zhì)X融合，構(gòu)建出BD-X質(zhì)粒載體；將AD基因與cDNA

2、文庫(kù)，基因片段或基因突變體（以Y表）融合，構(gòu)建AD-Y質(zhì)粒載體。兩個(gè)穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達(dá)。蛋白質(zhì)X和Y的相互作用導(dǎo)致了BD與AD在空間上的接近，從而激活UAS下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的酵母菌株特定報(bào)告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或LacZ）等的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化體由于HIS3或LEU2表達(dá)，而可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)因LacZ表達(dá)而在X-Gal存在下顯藍(lán)色。圖1-1酵母雙雜交基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)在發(fā)展中增添了接合型酵母雙雜交和反向酵母雙雜交系統(tǒng)。其中接合型雙雜交系統(tǒng)就是已預(yù)先將文庫(kù)轉(zhuǎn)化了某個(gè)接合型的單倍體酵母，然后再和轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的相反接合型的單倍體進(jìn)行接合，形成

3、二倍體，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與DBD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。酵母雙雜交系統(tǒng)常應(yīng)用在：(1)研究?jī)蓚€(gè)已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子區(qū)域。(2)用已知功能的蛋白做誘餌，在cDNA文庫(kù)中尋找有相互作用的

4、未知蛋白，以獲取蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)途徑信息。(3)以功能未知的新蛋白去篩選文庫(kù)，根據(jù)選到的靶蛋白的已知功能來(lái)推測(cè)該新蛋白的功能。(4)建立蛋白質(zhì)相互作用的圖譜。使用酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)注意如下問(wèn)題：(1)在篩選文庫(kù)之前，要檢測(cè)誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后表達(dá)的誘餌蛋白本身能否激活報(bào)告基因。(2)由于誘餌蛋白的存在致使報(bào)告基因His產(chǎn)生滲漏表達(dá)（leaky）。一般情況下，在培養(yǎng)基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His報(bào)告基因的滲漏表達(dá)。(3)在完成篩選之后，需檢測(cè)獵物蛋白是否自激活。一個(gè)完整的利用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白的實(shí)驗(yàn)包括cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，誘

5、餌基因載體構(gòu)建，載體轉(zhuǎn)化酵母，報(bào)告基因滲漏表達(dá)滴定，酵母接合實(shí)驗(yàn)，報(bào)告基因表型的測(cè)定，誘餌蛋白與靶蛋白相互作用復(fù)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)只完成酵母接合實(shí)驗(yàn)，報(bào)告基因表型的測(cè)定。在本實(shí)驗(yàn)中，pDEST32質(zhì)粒攜帶誘餌蛋白MED25，營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因是Leu2，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）AH109（Mata，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4△，gal80△，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ，ME

6、L1）菌株中；pDEST22質(zhì)粒攜帶的靶蛋白文庫(kù)來(lái)自擬南芥轉(zhuǎn)錄因子，營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因是Trp1，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y187（MATαura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,met–,gal80Δ,MEL1,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ）菌株中。報(bào)告基因使用HIS3。誘餌載體和獵物載體的啟動(dòng)子都是酵母組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ADH。其中，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)是組分特異的庫(kù)（specificlibraries），相對(duì)傳統(tǒng)全cDNA庫(kù)而言，它不受組分的組織表達(dá)特異性、發(fā)

7、育階段特異性以及表達(dá)量低的影響，提高了篩選效率。該庫(kù)由1000多個(gè)獨(dú)立的克隆組成，篩選后不需測(cè)序。圖1-2實(shí)驗(yàn)材料示意三、材料、試劑、儀器1.材料酵母菌株AH109含有pDEST32-bait質(zhì)粒(Leu)酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22-prey質(zhì)粒(Trp)，共有4個(gè)不同基因酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22空質(zhì)粒(Trp)2.試劑液體YPAD培養(yǎng)基30ml液體SD-Trp培養(yǎng)基30ml液體SD-Leu培養(yǎng)基5ml固體SD-Trp-Leu培養(yǎng)基30m