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1、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設計原理報告質粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉錄活性為零，該基因的篩選標志為URA3，可以作為有自主復制能力的質粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質粒pLexA的篩選標志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達DNA-BD(202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標蛋白(釣餌，Bait)的融合蛋白，該融合體的表達受酵母強啟動子ADH1的調控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結合。
2、質粒pB42AD的篩選標志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(EcoRI與XhoI)上游，含有SV40核定位(SV40nuclearlocalization)、HA(血凝素)及AD(來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白)等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉錄表達的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu，它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。根據雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉錄和表達。分別將待測蛋白X、Y的編碼
3、序列插入pLexA質粒載體和pB42AD質粒載體的多克隆位點中，然后共同轉入含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動報告基因的轉錄和表達，通過檢測報告基因的表達情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1.??載體質粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2.??酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM
4、4271（EGY48的伴侶菌株）3.??大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4.??對照質粒：質粒??用途pLexA-53，pB42AD-T??陽性對照pLexA-Pos(LexA/GAL4AD融合蛋白〕??陽性對照pLexA-Lam(LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用)??假陽性檢測質粒5.??引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實驗的基本流程1.??將報告基因p8op-LacZ轉化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.??同時構建或擴增DNA文庫，并純化足夠的質粒以轉化酵母細胞。3.??構建DNA-BD
5、/靶蛋白質粒pLexA-X，作為釣餌(bait)。4.??將上述釣餌質粒pLexA-X轉化EGY48(p8op-LacZ)細胞株，用SD/-His/-Ura篩選；并用固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細胞是否具有殺傷毒性。轉化質粒??選擇培養(yǎng)基??克隆生長情況??說明??(含有Gal/Raf)????pLexA-Pos??SD/-His，-Ura??藍??陽性對照pLexA??SD/-His，-Ura??白??陰性對照PlexA-X??SD/-His，-Ura
6、??白??沒有直接激活活性PlexA-X??SD/-His，-Ura??藍??具有直接激活活性PlexA-X??SD/-His，-Ura??菌落不能生長??酵母細胞毒性4-1.??如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號作用。b能夠自動激活報告基因，則設法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少4-2.??如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因，但對酵母宿主細胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉化酵母。5.??如果pLexA-X既不會自動激活報告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫DNA同時、或順序轉化酵母細胞，并檢測質
7、粒轉化效率。轉化??質粒??SD固體培養(yǎng)基??LacZ表型對照1??pLexA-Pos??Gal/Raf/-His/-Ura??藍對照2??pLexA-53??Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu??藍??＋pB42AD-T????實驗??pLexA-X??Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu??待測??＋pB42AD-文庫????5-1.??用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉化子，并擴增，使宿主細胞中的質粒在誘導前達到最大拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無表達。b5-2.??上述重組子轉至含X-gal
8、的固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報告基因的表達情形，藍色克隆即為陽性。
