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《基因工程5基因克隆載體-質(zhì)粒ppt課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、基因克隆載體生物與食品工程學院1.載體的概念克隆載體是一種能攜帶外源DNA片段進入受體細胞，并在受體細胞中得以維持或表達的DNA分子。生物學本質(zhì)：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒改造后的產(chǎn)物。特點：能在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定存在和復制。2.載體的一般特征1.容易進入受體細胞2.自主復制3.篩選標記4.多克隆位點5.安全3.載體的種類1.質(zhì)粒載體2.噬菌體載體3.病毒載體4.質(zhì)粒生物學本質(zhì)：細胞內(nèi)染色體外的遺傳物質(zhì)。廣泛存在于細菌細胞中，也出現(xiàn)在某些藍藻、綠藻、眼蟲、衣藻和真菌等細胞中。結(jié)構(gòu)特征：供價閉環(huán)雙鏈環(huán)狀DNA。4.質(zhì)粒4.顯性質(zhì)粒
2、與隱蔽質(zhì)粒是否能使宿主細胞呈現(xiàn)出新性狀。受檢測手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽性的質(zhì)粒，未必是真正的隱蔽質(zhì)粒。4.常見的顯性質(zhì)粒F質(zhì)粒結(jié)合作用R質(zhì)?？股氐目剐再|(zhì)粒Col質(zhì)粒大腸桿菌素合成基因降解芳香烴、農(nóng)藥等毒物的降解質(zhì)粒誘導植物形成冠癭廇的Ti質(zhì)粒4.質(zhì)粒遷移自然條件下，某些質(zhì)粒能通過結(jié)合作用轉(zhuǎn)移到新宿主細胞內(nèi)。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移受一系列基因的控制細菌產(chǎn)生鞭毛，合成細胞表面物質(zhì)，促使宿主細胞與受體細胞結(jié)合，導致質(zhì)粒從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞接合質(zhì)粒非接合質(zhì)粒4.質(zhì)粒的復制在質(zhì)粒復制過程中，同時會合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定拷貝數(shù)時，合成
3、的阻遏物累積到阻止質(zhì)粒繼續(xù)復制的程度，質(zhì)粒復制停止。嚴謹型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒失控的質(zhì)粒載體（溫度）4.質(zhì)粒的不親和性兩種質(zhì)?？赡芄泊嬗谕凰拗骷毎校械膭t不行。1.受相同的阻遏物阻止。2.相同的膜結(jié)合位點。受體細胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒5.質(zhì)粒的提取氯化銫梯度離心EtBr嵌入的差別堿變性法6.構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的策略1.復制起始點2.限制性酶切位點3.標記基因4.載體本身應(yīng)盡可能小5.根據(jù)需要組裝各種小原件pSC101質(zhì)粒第一個用于克隆真核基因的大腸桿菌質(zhì)粒載體有四環(huán)素抗性基因含有EcoRI等酶的酶切位點嚴謹型復制質(zhì)粒ColE1質(zhì)
4、粒編碼大腸桿菌毒素E1基因和使宿主細胞對E1免疫的基因pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒是由多個質(zhì)粒通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建的質(zhì)粒。pSC101質(zhì)粒四環(huán)素抗性基因ColE1->pMB1質(zhì)粒提供復制起始點R1drd19質(zhì)粒氨芐青霉素抗性基因縮小體積pBR322質(zhì)粒大?。?.3kb抗氨芐青霉素抗四環(huán)素抗性基因內(nèi)部酶切位點抗性基因外部酶切位點pBR322質(zhì)粒的使用使用同一種酶切割pBR322和目的基因正確連接目的基因的質(zhì)粒自身連接的質(zhì)粒細菌沒有吸收pBR322質(zhì)粒通過篩選基因進行篩選pUC18/19pUC18/19由pBR322衍生
5、構(gòu)建而成刪除了pBR322的抗四環(huán)素基因保留氨芐青霉素的抗性基因添加乳糖操縱子的一個片段lacZ’（啟動子、調(diào)節(jié)因子、β-半乳糖苷酶的α-肽基因）添加多克隆位點MCSpUC18/19TA載體TA載體是針對PCR而設(shè)計的一種質(zhì)粒載體耐熱性DNA聚合酶（Taq酶）具有一種非模板依賴活性，可在PCR產(chǎn)物的3’端加上一個非配對的A，根據(jù)該特性，設(shè)計出一種5’端帶一個不配對的T，通過該質(zhì)粒，可以直接將PCR產(chǎn)物以TA連接方式進行克隆，即TA克隆。質(zhì)粒表達載體在克隆載體的基礎(chǔ)上添加表達原件，構(gòu)建成表達載體。在受體細胞內(nèi)可以穩(wěn)定維持并表
6、達外源目的基因。融合型表達載體pGEX非融合型表達載體pKK223-3分泌型表達載體pinIII影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素1.代謝負荷有質(zhì)粒的細胞代謝負荷大，復制慢2.拷貝數(shù)差度細胞個體之間質(zhì)?？截悢?shù)的差3.重組體系質(zhì)粒重組后以2倍的速度進行復制ThankYou
