《孔雀石綠ELISA》PPT課件

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1、隱形孔雀石綠多克隆抗體的制備及鑒定匯報(bào)人：導(dǎo)師：匯報(bào)時(shí)間：摘自《食品科學(xué)》01OPTIONS02OPTIONS03OPTIONS04OPTIONS實(shí)驗(yàn)背景及意義實(shí)驗(yàn)方法及過(guò)程實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析個(gè)人收獲目錄結(jié)構(gòu)孔雀石綠簡(jiǎn)介孔雀石綠(malachitegreen，MG)別名中國(guó)綠、品綠，屬于有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料，也是殺菌劑，可用作治理魚(yú)類或魚(yú)卵的寄生蟲(chóng)、真菌或細(xì)菌感染，也常用作處理受寄生蟲(chóng)影響的淡水水產(chǎn)。由于孔雀石綠具有高毒素、高殘留和致畸、致癌、致突變等副作用，當(dāng)其進(jìn)入生物體內(nèi)，就會(huì)快速代謝產(chǎn)生具有更強(qiáng)危害的隱性孔雀石綠(leucomalach

2、itegreen，LMG)。2002年5月中國(guó)農(nóng)業(yè)部將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》。2005年《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求孔雀石綠在水產(chǎn)品中的檢出率不得超過(guò)1g/1000t。多克隆抗體簡(jiǎn)介抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Moncloneantibody）。由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗

3、原決定簇，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。ELISA技術(shù)簡(jiǎn)介酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay）ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。本次試驗(yàn)采用的是間接酶聯(lián)免疫吸附法，示意圖如下：實(shí)驗(yàn)方法Step1化學(xué)合成法合成隱形孔雀石綠衍生物Step2隱形孔雀石綠衍生物與BSA偶聯(lián)制備免疫抗原Step3抗原免疫新西蘭白兔，獲取抗隱形孔雀石綠多克隆抗體Step4特異性抗體效價(jià)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)步驟一隱性孔雀石綠衍生物的合成隱性孔雀石綠的分子結(jié)構(gòu)不具有和蛋白偶聯(lián)的活

4、性基團(tuán)，所以合成帶有羧基的隱性孔雀石綠衍生物是與載體蛋白偶聯(lián)的基礎(chǔ)。半抗原能與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性。如果用化學(xué)方法把半抗原與某種純蛋白的分子（載體）結(jié)合，純蛋白會(huì)獲得新的免疫原性，并能刺激動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。4-甲?；郊姿?.2gN,N-二甲基苯胺3.2mL無(wú)水乙醇中回流24h(氮?dú)獗Ｗo(hù))氯化鋅3.2g將混合物溶于40mL甲醇中，用HCl調(diào)pH值至5.0過(guò)濾收集淡綠色結(jié)晶，用去離子水清洗，真空干燥，重結(jié)晶實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)步驟二隱性孔雀石綠-BSA全抗原的制備將前期實(shí)驗(yàn)合成的

5、隱性孔雀石綠衍生物用碳化二亞胺法合成免疫抗原隱性孔雀石綠-BSA。具體步驟如下：稱取8mgCLMG溶于0.1mol/L的含50%二甲基亞砜的MES緩沖液(pH6.0)中，加入4.4mg碳化二亞胺和2.6mgN-羥基琥珀酰亞胺?；旌衔锸覝?cái)嚢?0min，逐滴加入50mL1mg/mLBSA溶液中?；旌衔锸覝?cái)嚢?h，用0.1mol/LPBS(pH7.4)透析，去掉未反應(yīng)物，即制備出隱性孔雀石綠-BSA全抗原。BSA：牛血清蛋白碳二亞胺：主要用于活化羧基，使羥基和氨基間脫水形成酰胺鍵。PBS：磷酸鹽緩沖液，與人體血液等滲，主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、

6、氯化鈉以及氯化鉀。N-羥基琥珀酰亞胺：用于在酰胺鍵形成時(shí)活化羰基基團(tuán)，減少副產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)步驟三抗隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備應(yīng)用免疫抗原隱性孔雀石綠-BSA，采用常規(guī)免疫程序免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。空白組背部皮下注射甲試劑1ml/只兩周后，背部皮下注射乙試劑1ml/只兩周后，同上1周后采血制備抗血清，用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。并加強(qiáng)免疫，每次用量均為1mL0.4mg/mL的全抗原，且不加任何佐劑，隔周注射，直到抗體效價(jià)不再升高為止。甲試劑：將制備的完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，使抗原終質(zhì)量濃度為0.4mg/mL。乙試劑：換

7、做弗氏不完全佐劑乳化，其他處理同甲。獲取抗體時(shí)，采用頸動(dòng)脈插管取血，血樣先27℃放置1h，然后置于37℃2h，最后4℃過(guò)夜。肉眼觀察血塊收縮后，輕輕吸取血清。血清用硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。將2mL預(yù)處理的血清與等體積pH7.40.02mol/LPBS溶液混勻，于冰上拌并緩慢逐滴加入4mL飽和硫酸銨(預(yù)冷)。置4℃條件下3h，使其充分沉淀(或于4℃冰箱中靜置過(guò)夜)。6000r/min離心10min，棄上清液。用PBS溶解該沉淀至5mL，逐滴加飽和硫酸銨2.5mL(體積比0.5:1)，置0℃條件下3h。6000r/min離心10min，棄上清液。用PBS溶

8、解該沉淀至5mL。逐滴加飽和硫酸銨2.5mL(體積比0.5:1)，置0℃條件下3h。6000r/min離心1