孔雀石綠ELISA

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1、隱形孔雀石綠多克隆抗體的制備及鑒定匯報人：導(dǎo)師：匯報時間：摘自《食品科學(xué)》01OPTIONS02OPTIONS03OPTIONS04OPTIONS實驗背景及意義實驗方法及過程實驗結(jié)果及分析個人收獲目錄結(jié)構(gòu)孔雀石綠簡介孔雀石綠(malachitegreen，MG)別名中國綠、品綠，屬于有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料，也是殺菌劑，可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，也常用作處理受寄生蟲影響的淡水水產(chǎn)。由于孔雀石綠具有高毒素、高殘留和致畸、致癌、致突變等副作用，當(dāng)其進(jìn)入生物體內(nèi)，就會快速代謝產(chǎn)生具有更強危害的隱性孔雀石綠(leucomalachitegreen，LMG)。200

2、2年5月中國農(nóng)業(yè)部將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》。2005年《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》國家標(biāo)準(zhǔn)要求孔雀石綠在水產(chǎn)品中的檢出率不得超過1g/1000t。多克隆抗體簡介抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Moncloneantibody）。由多種抗原決定簇刺激機體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五

3、類抗體。ELISA技術(shù)簡介酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay）ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。本次試驗采用的是間接酶聯(lián)免疫吸附法，示意圖如下：實驗方法Step1化學(xué)合成法合成隱形孔雀石綠衍生物Step2隱形孔雀石綠衍生物與BSA偶聯(lián)制備免疫抗原Step3抗原免疫新西蘭白兔，獲取抗隱形孔雀石綠多克隆抗體Step4特異性抗體效價的測定實驗方法實驗步驟一隱性孔雀石綠衍生物的合成隱性孔雀石綠的分子結(jié)構(gòu)不具有和蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)，所以合成帶有羧基的隱性孔雀石綠衍生物是與載體蛋白偶聯(lián)的基礎(chǔ)。半抗原能與對應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗

4、體反應(yīng)、又不能單獨激發(fā)人或動物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性。如果用化學(xué)方法把半抗原與某種純蛋白的分子（載體）結(jié)合，純蛋白會獲得新的免疫原性，并能刺激動物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。4-甲?；郊姿?.2gN,N-二甲基苯胺3.2mL無水乙醇中回流24h(氮氣保護(hù))氯化鋅3.2g將混合物溶于40mL甲醇中，用HCl調(diào)pH值至5.0過濾收集淡綠色結(jié)晶，用去離子水清洗，真空干燥，重結(jié)晶實驗方法實驗步驟二隱性孔雀石綠-BSA全抗原的制備將前期實驗合成的隱性孔雀石綠衍生物用碳化二亞胺法合成免疫抗原隱性孔雀石綠-BSA。具體步驟如下：稱取8mgCLMG溶于0.1mol/L的含50%二甲基亞

5、砜的MES緩沖液(pH6.0)中，加入4.4mg碳化二亞胺和2.6mgN-羥基琥珀酰亞胺?；旌衔锸覝財嚢?0min，逐滴加入50mL1mg/mLBSA溶液中。混合物室溫攪拌2h，用0.1mol/LPBS(pH7.4)透析，去掉未反應(yīng)物，即制備出隱性孔雀石綠-BSA全抗原。BSA：牛血清蛋白碳二亞胺：主要用于活化羧基，使羥基和氨基間脫水形成酰胺鍵。PBS：磷酸鹽緩沖液，與人體血液等滲，主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀。N-羥基琥珀酰亞胺：用于在酰胺鍵形成時活化羰基基團(tuán)，減少副產(chǎn)物。實驗方法實驗步驟三抗隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備應(yīng)用免疫抗原隱性孔雀石綠-BSA，采用常

6、規(guī)免疫程序免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。空白組背部皮下注射甲試劑1ml/只兩周后，背部皮下注射乙試劑1ml/只兩周后，同上1周后采血制備抗血清，用免疫沉淀實驗檢測抗體效價。并加強免疫，每次用量均為1mL0.4mg/mL的全抗原，且不加任何佐劑，隔周注射，直到抗體效價不再升高為止。甲試劑：將制備的完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，使抗原終質(zhì)量濃度為0.4mg/mL。乙試劑：換做弗氏不完全佐劑乳化，其他處理同甲。獲取抗體時，采用頸動脈插管取血，血樣先27℃放置1h，然后置于37℃2h，最后4℃過夜。肉眼觀察血塊收縮后，輕輕吸取血清。血清用硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。將2mL預(yù)處理的血

7、清與等體積pH7.40.02mol/LPBS溶液混勻，于冰上拌并緩慢逐滴加入4mL飽和硫酸銨(預(yù)冷)。置4℃條件下3h，使其充分沉淀(或于4℃冰箱中靜置過夜)。6000r/min離心10min，棄上清液。用PBS溶解該沉淀至5mL，逐滴加飽和硫酸銨2.5mL(體積比0.5:1)，置0℃條件下3h。6000r/min離心10min，棄上清液。用PBS溶解該沉淀至5mL。逐滴加飽和硫酸銨2.5mL(體積比0.5:1)，置0℃條件下3h。6000r/min離心1