基因工程和克隆技術(shù)

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1、【注意點】限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復排列的。1.限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）2.DNA連接酶——E·coliDNA連接酶、T4DNA連接酶【對位訓練】限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：【思考】（2）（7）和（3）（6）可以交換連接嗎？可以接，但失去識別位點，接后不能再切開?！炯m錯】某土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（內(nèi)含T-DNA片段）3.載體（分子運輸車）此外，還有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等4.基因工程的基本

2、操作程序直接分離較小DNA合成儀RNA逆轉(zhuǎn)錄酶PCR基因組文庫；部分基因文庫（如cDNA文庫）——PCR技術(shù)擴增前提是：要有已知目的基因的核苷酸序列（以便根據(jù)這一序列合成引物）（2）基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。②基因表達載體的模式圖：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細胞法(用Ca2＋處理)受精卵、體細胞受精卵原核細胞【思考】若想將一個抗病基因利用“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法”導入單子葉植物，從理論上說應(yīng)該怎樣做？【轉(zhuǎn)化】目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且

3、在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程?！咎崾尽竣僖x擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化（酚類化合物）和誘導的物質(zhì)?！練w納總結(jié)】基因工程中受體細胞的選擇問題解讀：DNA分子(核酸)分子抗原—抗體目的基因表達出的性狀5.基因工程的應(yīng)用（1）（2）預期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→推測脫氧核苷酸序列→合成DNA→表達出蛋白質(zhì)6.蛋白質(zhì)工程（1）流程圖：中心法則的逆推（2）基因修飾或基因合成——第二代基因工程7.植物細胞工程植物細胞融合植物組織培養(yǎng)脫分化再分化避光，有光過早刺激分化優(yōu)點：克服遠緣雜交不親和的障礙。（1

4、）流程圖原理：細胞膜的流動性和細胞的全能性（2）應(yīng)用①微型繁殖：保優(yōu)，高效快速，大量繁殖種苗。②作物脫毒：利用分生組織(如莖尖、根尖)進行培養(yǎng)。③人工種子：注：人工種皮中可以加入適量的養(yǎng)分、無機鹽、有機碳源以及農(nóng)藥,抗生素,有益菌等,以利于胚狀體生長發(fā)育成幼苗。④作物新品種的培育單倍體育種突變體的利用細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)8.動物細胞工程（1）動物細胞培養(yǎng)流程圖【培養(yǎng)條件解讀】①無菌、無毒的環(huán)境——無菌處理、加抗生素殺菌、定期更換培養(yǎng)液。②營養(yǎng)——葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽和微量元素＋血清或血漿等天然成分。原理：細胞增殖③溫度和pH——(36.5±0.5

5、)℃和(7.2～7.4)。④氣體環(huán)境——95%空氣＋5%CO2?！咎崾尽緾O2作用——調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH；空氣中O2作用——細胞有氧呼吸；所用裝置——CO2培養(yǎng)箱。⑤應(yīng)用生產(chǎn)細胞產(chǎn)品：干擾素、疫苗、單克隆抗體。檢測并判斷某毒性物質(zhì)毒性的大小。臨床醫(yī)學研究。（2）動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物流程圖：原理：動物細胞核的全能性【流程圖解讀】①卵母細胞選擇時期及原因：減Ⅱ中期的卵母細胞，此時具備受精能力，細胞質(zhì)中合成與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)能刺激融合后重組細胞進行分裂分化，形成重組胚胎。②選卵細胞作為受體細胞的原因：大，易于操作；卵黃多，營養(yǎng)豐富，為發(fā)育提供充足的營養(yǎng)；能

6、激發(fā)重組細胞分裂分化。③該過程用到的技術(shù)手段：動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植?？寺〗M織培養(yǎng)試管動物(嬰兒)生殖方式無性無性有性遺傳物質(zhì)來源2個親本1個親本2個親本性別決定提供核親本一般沒有精子類型用途優(yōu)良種畜快速繁育，可選擇性別快速繁殖無病毒植株解決不孕不育現(xiàn)狀不成熟成熟成熟④概念區(qū)別（3）動物細胞融合與單克隆抗體的制備流程圖：原理：細胞膜的流動性