過氧化物酶POD的測定.doc

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1、過氧化物酶活性的測定愈創(chuàng)木酚法目的意義過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高低與酚類物質(zhì)代謝、物抗性密切相關(guān)。通過實驗掌握提取POD和測定其活性的方法及其原理。過氧化物酶催化H202氧化酚類，生成醌類化合物，此化合物進一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的產(chǎn)物。本實驗以愈創(chuàng)木酚為底物，過氧化物酶催化H202將愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在470nm波長處有最大吸收峰，故可通過測定470nm波長下的吸光度變化得知過氧化物酶的活性。三、材料、設備和試劑1．材料馬鈴薯或小麥芽、未成熟的蘋果、新鮮茶葉等。2．設備721型分光光度計、離心機

2、、秒表(或手表)、天平、研缽、磁力攪拌器。3．試劑愈創(chuàng)木酚、30％過氧化氫、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸緩沖液(pH6．0)。反應混合液配制取100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50ml于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28μl，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚完全溶解，待溶液冷卻后，加入30％過氧化氫19μl以，混合均勻，保存于冰箱中。三、操作方法1．酶液制備稱取植物材料1g，加入20mmol/LKH2PO4溶液5m1，于研缽中研磨成勻漿，在33000r/min下離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25m1容量瓶中，殘渣再用5ml

3、KH2PO4溶液提取一次，合并兩次上清液，定容，混勻，貯于冷涼處備用。2．比色測定取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入已混勻的反應混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作為參比液；另一只中加入反應混合液3ml，酶液1m1(如酶活性過高可稀釋之)，立即記時并置于分光光度計中。在470nm下測定光密度，每隔1min讀數(shù)一次，連續(xù)測30min，每次測定前重新用對照校準。若氣溫較低，應適當提高室溫，以37℃為最適宜。四、實驗結(jié)果1．以時間為橫坐標，光密度為縱坐標作圖。反應前期過氧化氫酶活性隨反應時間直線上升，升到最大值后，其相關(guān)曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，轉(zhuǎn)折出現(xiàn)

4、的早晚取決于溫度。在曲線的前期部分找到一段近似直線的部分，和直線起點時間t1和光密度A1、直線終點時間t2和光密度A2。2.計算以沒minA470變化0.01為1個過氧化物酶活單位（μ），計算其活力及比活力。酶活力（0.01A470·min-1）=A2-A1/（t2-t2）×0.01×D酶的比活力（u·g-1）=酶活力（μ）/樣品重（g）或樣品中蛋白質(zhì)含量（mg）A2-A1：吸光度的變化t2-t2：時間變化D：稀釋倍數(shù)，即提取的酶液總量為反應系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)。U：酶活力單位（即0.01A470·min-1）