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《番茄抗細(xì)菌斑點病基因Pto的圖位克隆.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、圖位克隆的原理和步驟——以Pto基因的克隆為例圖位克隆圖位克隆（Map-basedcloning）又稱定位克?。╬ositionalcloning），1986年首次由劍橋大學(xué)的Alancoulson提出。用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。它是通過分析目的基因與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定目的基因在染色體上的位置。1992年擬南芥ABI3基因（Giraudatetal.,1992）和FAD3基因（Arondeletal.,1992）首先通過圖位克隆的方法分離出來。圖位克隆的主要步驟初步定位構(gòu)建連鎖圖譜精細(xì)
2、定位初步定位構(gòu)建連鎖圖譜精細(xì)定位分離群體：F2、BC1、DH等分子標(biāo)記：SSR、CAPSAFLP、RFLP、RAPD等群體大?。?00-200單株一般通過初步定位可以篩選出距離目的基因5-10cM的側(cè)翼標(biāo)記。初步定位構(gòu)建連鎖圖譜精細(xì)定位整合已有的遺傳圖譜，將不同類型的分子標(biāo)記整合到一起；對于已經(jīng)測序的物種，根據(jù)目的基因附近的DNA序列設(shè)計新的分析標(biāo)記；利用比較基因組的共線性，從同科屬的其他生物上獲得分子標(biāo)記。初步定位構(gòu)建連鎖圖譜精細(xì)定位群體大?。?000-4000株利用側(cè)翼標(biāo)記篩選出重組單株，然后用所有的多態(tài)性標(biāo)記對重組單株進行分析，結(jié)合表型鑒定結(jié)果，將目的基因定位到0.5cM甚至更小的
3、范圍內(nèi)。物理距離≠遺傳距離初步定位不同染色體區(qū)段重組值的不同會影響遺傳距離的大小，因此物理圖譜才是真正意義上的基因圖譜，既分子標(biāo)記與目的基因之間的距離應(yīng)該由實際的堿基數(shù)來計算。染色體分帶圖、限制酶切圖譜、跨疊克隆群、DNA序列圖譜等。初步定位用與目的基因兩側(cè)連鎖最緊密的分子標(biāo)記雜交篩選大片段DNA文庫中的陽性克隆，找到對應(yīng)的大片段克隆，然后從兩端進行染色體步移，直到獲得具有目的基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段克隆或跨疊群。初步定位用含有目的基因的大片段克隆如BAC或YAC克隆去篩選cDNA文庫，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫，確定候選基因。然后，(1)cDNA與目的基因是否共分離；(2)cDNA的時空表達(dá)
4、與表型是否一致；(3)測定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，了解基因的功能；(4)篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；(5)進行功能互補試驗。初步定位功能互補試驗（轉(zhuǎn)基因）是最直接、最終鑒定基因的方法。利用RNA干擾（RNAi）也可有效地確定目的基因。Pto基因的初步定位Fig.1RFLPmapofchromosome5oftomatoshowingthelocationofthePtogeneandlinkedmarkers.ThehatchedregionrepresentsthechromosomalsegmentderivedfromL.pimpinellifolium
5、thatispresentintheNILRioGrande-PtoR.Fig.2Thehigh-resolutionlinkagemapofthePtolocus.co-segragatedwithPto1200F2individualsderivedfromacrossbetweenNILs(RioGrande-PtoRandRioGrande)高密度連鎖圖譜及精細(xì)定位物理圖譜構(gòu)建Fig.3GeneticmapofthePtoregiononchromosome5(boldline).RFLPmarkerTG538wasusedtoscreenatomatoYAClibrary.A4
6、00-kbclone,PTY538-1wasidentifiedthathybridizedtothismarker.PTY538wasusedtoprobeatomatoleafcDNAlibrary.TwoofthecDNAclones,CD127andCD186,cosegregatedwithPto.Fig.4(A)DNAblotanalysisofthePtogenefamilyintomato.(B)DNAblotanalysisofYACPTY538-1.確定候選基因TheCD127clonedetectednumerouspolymorphicfragmentswhenh
7、ybridizedwithblotsofgenomicDNAfromRioGrande-ProRandRioGrandeplants.Doestheclonecontainexonsspanningalargeregionorthatitpresentsafamilyofrelatedgenes?TheYACcontainedalloftheCD127-hybridizingfragments,withtheexceptionofa
