菌種毒力試驗(yàn)方法.doc

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1、菌種毒力試驗(yàn)方法一、產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基的制備1.馬鈴薯-酵母膏-蔗糖培養(yǎng)基取去皮馬鈴薯200-300g，切成小塊，加水1000mL，煮沸20min，紗布過(guò)濾，制成馬鈴薯汁并補(bǔ)充水分至1000mL，加入10g酵母膏，100g蔗糖，分裝后121℃高壓滅菌15min。2.麥芽汁-酵母膏培養(yǎng)基1000mL麥芽汁中加入10g酵母膏，分裝后121℃高壓滅菌15min。3.麥芽汁-蛋白胨培養(yǎng)基1000mL麥芽汁中加入1g蛋白胨，分裝后121℃高壓滅菌15min。4.葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基葡萄糖10.0g天門(mén)冬素0.5

2、gK2HPO40.5g蒸餾水1000.0mL調(diào)pH7.2-7.4，分裝后121℃高壓滅菌15min。5.高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4·7H2O0.01g蒸餾水1000.0mL調(diào)pH7.2-7.4，分裝后121℃高壓滅菌15min。6.麥芽汁培養(yǎng)基200mL麥芽汁分裝后，121℃高壓滅菌15min。7.0.5%蛋白胨培養(yǎng)基取2.0g葡萄糖，0.6g酵母膏，1.0g蛋白胨，4.0g瓊脂，加蒸餾水至200

3、mL，分裝后121℃高壓滅菌15min。二、培養(yǎng)物制備將送檢菌種或轉(zhuǎn)種的純培養(yǎng)物（適宜的培養(yǎng)基斜面，28±1℃培養(yǎng)5-7d），確證為純培養(yǎng)物后，分別接種于適宜的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，一般菌種接種于麥芽汁-酵母膏、麥芽汁-蛋白胨及馬鈴薯-酵母膏-蔗糖三種產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，放線菌接種于葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基和高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基中，紅發(fā)夫酵母接種于麥芽汁培養(yǎng)基和0.5%蛋白胨培養(yǎng)基中，置28±1℃培養(yǎng)14d。將培養(yǎng)物經(jīng)流動(dòng)蒸汽1h后，過(guò)濾，所得濾液部分于80℃恒溫下濃縮2.5倍備用，余者直接供實(shí)驗(yàn)用。一、小鼠毒力實(shí)驗(yàn)

4、每種產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基需小鼠80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分為4組，每組10只。劑量組設(shè)置為：培養(yǎng)基空白對(duì)照組、培養(yǎng)基2.5倍濃縮空白對(duì)照組、培養(yǎng)物原液組、培養(yǎng)物2.5倍濃縮組。將受試物以20.0mL/kgBW的劑量給小鼠一次性灌胃后觀察14d，記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠的中毒表現(xiàn)及死亡情況。二、試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)對(duì)小鼠的初始體重、終體重各實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)資料用t’檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。三、結(jié)果判定麥芽汁-酵母膏麥芽汁-蛋白胨馬

5、鈴薯-酵母膏-蔗糖培養(yǎng)基空白對(duì)照組培養(yǎng)基2.5倍濃縮空白對(duì)照組培養(yǎng)物原液組培養(yǎng)物2.5倍濃縮組小鼠的初始體重各組間均衡，受試物對(duì)終體重?zé)o不良影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠未出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡，可判定受試菌種安全。