菌種測定方法.doc

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1、附　錄　A（規(guī)范性附錄）枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、植物乳桿菌的計數和雜菌率的測定A.1　原理每個活菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下，經過合適的培養(yǎng)時間可繁殖成一個肉眼可見的菌落，通過對菌落數量的統(tǒng)計，便可計算出相應樣品的單位活菌數。A.2　培養(yǎng)基除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和符合GB/T6682規(guī)定的三級水或相當純度的水。按本標準規(guī)定的方法配制培養(yǎng)基或購買商品化的產品。A.2.1　枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基A.2.1.1　成分營養(yǎng)瓊脂33g；蒸餾水1000mL。A.2.1.2　制法將33g營養(yǎng)瓊脂溶解于蒸餾水中，定容至1000mL；121℃滅菌20min。A.2.2

2、　釀酒酵母菌培養(yǎng)基A.2.2.1　成分孟加拉紅培養(yǎng)基36.6g；蒸餾水1000mL。A.2.2.2　制法將36.6g孟加拉紅培養(yǎng)基溶解于蒸餾水中，定容至1000mL；121℃滅菌20min。A.2.3　植物乳桿菌培養(yǎng)基A.2.3.1　成分蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母提取物5g；磷酸氫二鉀2g；檸檬酸三銨2g；乙酸鈉5g；葡萄糖20g；吐溫-801mL；七水硫酸鎂0.58g；四水硫酸錳0.25g；瓊脂粉20g；滅菌碳酸鈣3g；蒸餾水1000mL。A.2.3.2　制法將上述試劑依次溶解于蒸餾水中，七水硫酸鎂和四水硫酸錳單獨用蒸餾水溶解后混入前述溶液中，最后加入瓊脂粉，定容至10

3、00mL；121℃滅菌20min。A.2.4　麥康凱培養(yǎng)基A.2.4.1　成分蛋白胨17g；脙胨3g；豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g；氯化鈉5g；瓊脂17g；蒸餾水1000mL；0.01%結晶紫水溶液10mL；0.5%中性紅水溶液5mL。A.1.1.1　制法A.將蛋白胨、脙胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正pH7.2。將瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶內，121℃高壓滅菌15min備用。B.臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50～55℃時，加入結晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。（注：結晶紫及中性紅水溶液配好后須經高壓滅菌）A.2　儀器

4、與設備A.2.1　超凈工作臺。A.2.2　天平：感量：0.01g。A.2.3　震蕩器。A.2.4　高壓滅菌器：≥121℃。A.2.5　生化培養(yǎng)箱：±1℃。A.2.6　玻璃培養(yǎng)皿。A.2.7　移液器：精度為1μL。A.2.8　顯微鏡：1000倍。A.2.9　玻璃或塑料涂布棒。A.3　樣品制備按GB/T14699.1的規(guī)定，采取有代表性的樣品200g，按GB/T20195制備試樣，裝入樣品瓶中做好標記后備用。A.4　測定步驟A.4.1　樣品稀釋準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋轉式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成10

5、-1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10-1稀釋液1mL移入裝有9mL無菌水的試管中，充分混勻即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2菌液1mL移入裝有9mL無菌水試管中，即成10-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋度菌液，供平板接種用。A.4.2　涂布枯草芽孢桿菌用涂布法：每個樣品根據菌量不同取兩個相鄰合適稀釋梯度，用1mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至直徑為9cm的培養(yǎng)基平皿的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌玻璃涂布棒將菌懸液均勻涂于瓊脂表面。每個稀釋梯度做三個平行，同時用無菌水作為空白對照。釀酒酵

6、母菌用混勻法：每個樣品根據菌量不同取兩個相鄰合適稀釋梯度，用1mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液1mL，加至直徑為9cm平皿中，當培養(yǎng)基冷卻至45℃左右(實驗中用手觸摸溫熱即可)，在每個培養(yǎng)皿中各倒入約15mL培養(yǎng)基，然后迅速旋動培養(yǎng)皿，使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置水平位置靜止后使之凝固。每個梯度做三個平行，同時用無菌水作為空白對照。植物乳桿菌用混勻法：每個樣品根據菌量不同取兩個相鄰合適稀釋梯度，用1mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液1mL，加至直徑為9cm平皿中，當培養(yǎng)基冷卻至45℃左右(實驗中用手觸摸溫熱即可)，在每個培養(yǎng)皿中各倒入約15mL培養(yǎng)基，然后迅速旋動培養(yǎng)皿，

7、使菌懸液與培養(yǎng)基充分混勻，置水平位置靜止后使之凝固。每個梯度做三個平行，同時用無菌水作為空白對照。A.1.1　培養(yǎng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基平皿置培養(yǎng)箱內37℃倒置培養(yǎng)17-22h；釀酒酵母菌培養(yǎng)基平皿冷凝后置培養(yǎng)箱內28℃倒置培養(yǎng)48h；植物乳桿菌培養(yǎng)基平皿冷凝后37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，分別觀察菌落形態(tài)，鑒別后計數。A.1.2　菌落特征A.1.2.1　枯草芽孢桿菌：培養(yǎng)基平皿置培養(yǎng)箱內37℃倒置培養(yǎng)24h后，菌落不規(guī)則，粗糙，不透明，不閃光，蔓延，污白色。A.1.2.2　釀酒酵母菌：培養(yǎng)基平皿