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《無創(chuàng)產(chǎn)前技術(shù).ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒DNA檢測技術(shù)簡介唐氏綜合征47,XY,+2121-三體綜合征，又稱先天愚型或Down綜合征，是小兒最為常見的常染色體畸變疾病。我國活產(chǎn)嬰兒中21-三體綜合征的發(fā)生率約為1/600～1/800，男女之比為3︰2，60%的患兒在胎兒早期即夭折流產(chǎn)。傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法游離胎兒DNA胎兒細胞游離胎兒RNA孕婦外周血胎兒細胞（fetalcell）種類滋養(yǎng)層細胞、胎兒有核紅細胞、胎兒淋巴細胞、胎兒粒細胞特點包含完整的胎兒基因組可反映胎兒全部遺傳信息數(shù)目少，限制其應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷游離胎兒DNA Cell-freefetal(cff)DNADennisLo盧煜明
2、特點：1含量是孕婦血液中胎兒細胞DNA的970倍2含量有一定的變化規(guī)律，妊娠第5周開始可以檢測出胎兒游離DNA，隨著孕周增加而增加，存在個體差異3分娩后短時間內(nèi)消失，平均半衰期為16.3min（4-30min），2h后沒法檢出。ChrN:100Chr21:100理論模型正常胎兒21三體胎兒Descriptionofthecontents正常胎兒Chr11:2000Chr21:20001000基因等分/ml（含50等份的胎兒基因;950等份的母親基因）ChrN:1900Chr21:1900ChrN:100Chr21:150母親21三體胎兒ChrN:2000Chr21:2050統(tǒng)
3、計結(jié)果:T21>正常胎兒血漿技術(shù)流程末端修復(fù)加“A”尾接頭連接文庫制備（1天）LM-PCR上機測序報告發(fā)送數(shù)據(jù)分析上機測序和數(shù)據(jù)分析（2天）C-botDNA提取血漿分離樣品處理（1天）血液采集DNA提取后質(zhì)控收樣質(zhì)控文庫質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果審核醫(yī)院血樣采集血樣寄送包裝技術(shù)流程末端修復(fù)加“A”尾接頭連接文庫制備（1天）LM-PCR上機測序報告發(fā)送數(shù)據(jù)分析上機測序和數(shù)據(jù)分析（2天）C-botDNA提取血漿分離樣品處理（1天）血液采集DNA提取后質(zhì)控收樣質(zhì)控文庫質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果審核醫(yī)院4℃，1600g10min4℃，16000g10min殘留細胞取上清樣品處理兩步法分離血漿：-80保存
4、在樣品制備過程中，具有以下任意一條不合格的，判定為不合格品：(1)血漿分離后存在明顯的溶血；(2)分離后血漿體積未達到最低要求(要求大于1.2ml)；(3)血漿全部用于DNA提取后總量未達建庫最低要求(30ng)；(4)DNA提取過程中，陰性對照可以檢測到濃度。樣品處理DNA提取使用微量樣品基因組提取試劑盒(天根，DP316)進行血漿游離DNA提取技術(shù)流程末端修復(fù)加“A”尾接頭連接文庫制備（1天）LM-PCR上機測序報告發(fā)送數(shù)據(jù)分析上機測序和數(shù)據(jù)分析（2天）C-botDNA提取血漿分離樣品處理（1天）血液采集DNA提取后質(zhì)控收樣質(zhì)控文庫質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果審核末端修復(fù)和加“A”接
5、頭連接TDNAinsert+PCRP5P7Index公用P1IndexPCRprimerDNAinsertP5P7IndexSP1SP2IdxSPP7P5PCR擴增2100檢測片段大小文庫質(zhì)控電泳結(jié)果在文庫制備過程中，具有以下任意一條不合格的，判定為不合格文庫：(1)電泳檢測后發(fā)現(xiàn)接頭未連接；(2)電泳檢測或2100檢測后發(fā)現(xiàn)存在接頭污染；(3)2100檢測后發(fā)現(xiàn)文庫片段大小不合格，文庫主峰大小為290bp左右，次峰大小為450bp左右；(4)定量檢測后，發(fā)現(xiàn)文庫的濃度過低(濃度低于30ng/ul)文庫不合格標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流程末端修復(fù)加“A”尾接頭連接文庫制備（1天）LM-PCR上
6、機測序報告發(fā)送數(shù)據(jù)分析上機測序和數(shù)據(jù)分析（2天）C-botDNA提取血漿分離樣品處理（1天）血液采集DNA提取后質(zhì)控收樣質(zhì)控文庫質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果審核將被打斷成幾百個堿基（或更短），并在兩個末端加上接頭(adapter)的基因片段按一定濃度進行稀釋。將基因片段固定在芯片(FlowCell)上。由于芯片表面連接有一層單鏈引物(Primer)，經(jīng)處理后的堿基片段與芯片上的引物進行互補連接，被“固定”在芯片上。引物擴增，以樣品為親本鏈，使芯片引物延長形成復(fù)制鏈。ClusterGenerationOHFlowCell接頭diolP7P5dioldiol模板雜交dioldiol延長dio
7、ldiol變性堿基片段雜交剩下的復(fù)制鏈其一端“固定”在芯片上，另外一端隨機和附近的另外一個引物互補，被“固定”住，形成“橋”(bridge)。形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴增引物，在芯片表面進行擴增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，并作為下一輪擴增的模板繼續(xù)擴增反應(yīng)。反復(fù)若干輪擴增，每個單分子得到了大量擴增，成為單克隆“DNA簇群”。dioldiol1stcycle變性1stcycle退火dioldiol1stcycle延長dioldioldioldiol2ndcycle變性2ndcycle退火
