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1、沙門菌檢查法1簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第一卷（1984），沙門菌分5個(gè)亞屬。2003年出版的第八版的臨床微生物手冊(cè)將沙門菌屬分成兩個(gè)菌種即腸炎沙門菌和乍得沙門菌，其中腸炎沙門菌分6個(gè)亞種，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、，鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌雜內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2501個(gè)血清型。O抗原抗血清A-E群包含了沙門菌分離株的95%，所以常用沙門菌A-FO多價(jià)血清進(jìn)行沙門菌初篩試驗(yàn)。藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)，即對(duì)沒10g（或10ml）藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗(yàn)報(bào)告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及
2、血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等步驟。2儀器、設(shè)備及用具（見大腸埃希菌2）。3試液指示液（參見大腸埃希菌3）3.1無菌脲試液[附錄2.5]。3.2酚磺酞指示液[附錄4.4]。3.3亮綠試液[附錄2.9]。3.4氰化鉀試液[附錄2.14]。3.5溴甲酚紫指示液[附錄4.5]。3.6革蘭染色液[附
3、錄2.4，2.10，2.16]。3.7沙門菌屬A-F“O”多價(jià)血清（即O多價(jià)1）生物制品研究所供應(yīng)。4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]。4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]。4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.3]。4.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）[附錄5.8]。4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）[附錄5.9]。4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）[附錄5.11]。4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）[附錄5.10]。4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）[附錄5.13]。4.9沙門菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）[附錄5.12]。4.10蛋白胨水培養(yǎng)基[附錄5.1
4、8]。4.11脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.23]。4.12氰化鉀培養(yǎng)基[附錄5.24]。4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基[附錄5.25]。5對(duì)照用菌液取乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]是營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106（濃度相當(dāng)于50～100cfu/0.1ml），作陽性對(duì)照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計(jì)數(shù)法測得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點(diǎn)計(jì)求得。6操作方法6.1準(zhǔn)備工作：（見細(xì)菌、霉
5、菌和酵母菌計(jì)數(shù)6）。6.2供試液的制備：（見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備：（見大腸埃希菌6.2）。6.3陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)、陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)（見大腸埃希菌7.1）。6.4增菌培養(yǎng)6.4.1預(yù)增菌取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品使勻，另1份加入稀釋劑10ml作陰性對(duì)照，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察。搖動(dòng)陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清亮透明，無菌生長。6.4.2增菌培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶，吸取1ml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)18～24h。6.5分離培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)，以接種環(huán)沾取1
6、～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門菌志賀菌瓊脂（SS）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)24～48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)特征見表1。表1沙門菌的菌落特征平板菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂（DHL）無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（SS）無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC）無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，
7、菌落不著色，一般為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特征有時(shí)不明顯，沙門菌屬亞屬Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別。6.6初步鑒別試驗(yàn)從每個(gè)供試品的分離平板上挑取2～3個(gè)疑似菌落（菌落形態(tài)特征與表1所列的形態(tài)特征相符或疑
