基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展

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1、蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院綜合能力訓(xùn)練Ⅰ——文獻(xiàn)綜述題目：基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展作者：王劍學(xué)號：201207739指導(dǎo)教師：謝放完成日期：2014-7-16基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展摘要：為能快速而準(zhǔn)確地克隆目的基因,綜述了一些基因克隆常用技術(shù),包括差異表達(dá)基因分離技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、圖位克隆技術(shù)、同源序列技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)的原理、應(yīng)用及應(yīng)用潛力,并對其作了簡要的評價.這些技術(shù)有利有弊,應(yīng)根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮退絹磉x擇相應(yīng)的技術(shù).關(guān)鍵詞：基因;克隆;差異表達(dá)基因分離技術(shù);轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù);圖位克隆技術(shù);同源

2、序列技術(shù);表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)克隆通常是一種人工誘導(dǎo)的無性生殖方式或者自然的無性生殖方式（如植物）。一個克隆就是一個多細(xì)胞生物在遺傳上與另外一種生物完全一樣?？寺】梢允亲匀豢寺。缬蔁o性生殖或是由于偶然的原因產(chǎn)生兩個遺傳上完全一樣的個體（就像同卵雙生一樣）。但是我們通常所說的克隆是指通過有意識的設(shè)計來產(chǎn)生的完全一樣的復(fù)制?！　】寺〖夹g(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)中被稱為“生物放大技術(shù)”，它已經(jīng)歷了三個發(fā)展時期：第一個時期是微生物克隆，即用一個細(xì)菌很快復(fù)制出成千上萬個和它一模一樣的細(xì)菌，而變成一個細(xì)菌群；第二個時期是生物技術(shù)克隆，

3、比如用遺傳基因――DNA克??；第三個時期是動物克隆，即由一個細(xì)胞克隆成一個動物?？寺【d羊“多莉”由一頭母羊的體細(xì)胞克隆而來，使用的便是動物克隆技術(shù)?？寺』虻耐緩接袃煞N,正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑.前者是依據(jù)目標(biāo)基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ),通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進(jìn)行的;后者則著眼于基因本身,通過特定的序列或在基因組中的位置進(jìn)行.近幾十年來,許多重點實驗室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性進(jìn)展.基因的克隆一般采用下列技術(shù):差異表達(dá)基因分離技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、圖位克隆技術(shù)和同源序

4、列技術(shù)等.1差異表達(dá)基因分離技術(shù)1.1扣除雜交技術(shù)扣除雜交技術(shù)的原理是用有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA探針,與無特異性表達(dá)基因的參照樣的過量mRNA或cDNA雜交,經(jīng)兩輪充分雜交后,移去雜交分子和過量的無特異性表達(dá)基因的參照樣mRNA或cD2NA,將不形成雜交體的有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣cDNA純化富集、擴(kuò)增,建立相應(yīng)cDNA文庫即為差異表達(dá)基因cDNA文庫.此技術(shù)最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他們先用超聲波打斷雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DN

5、A;將兩者一起變性、復(fù)性,再將產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體的BamHI位點中,只有那些兩端有GATC序列的基因才能被克隆入載體,這樣就達(dá)到了扣除兩者共有序列的目的,并得到雄性小鼠Y染色體的DNA.該法的缺點是技術(shù)要求較高、工作量大,并且有時得出的數(shù)據(jù)不大可靠.然而經(jīng)過多年的改進(jìn),扣除雜交技術(shù)已發(fā)展成為眾多克隆技術(shù)的基礎(chǔ),很多克隆技術(shù)都是從此技術(shù)衍生發(fā)展而來,如抑制性扣除雜交技術(shù).它是先將樣本mRNA和參照mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用4種堿基識別并酶切兩種cDNA以產(chǎn)生平端片段;樣本mRNA分布接上接頭1和接頭2,并與

6、過量的經(jīng)Rsa1消化的參照樣本雜交;在接頭處設(shè)計引物,使具有差異表達(dá)的片段成為PCR擴(kuò)增的模板,重復(fù)雜交以減少非特異性擴(kuò)增片段,利用接頭上的酶切位點進(jìn)行克隆和測序.1.2差式篩選技術(shù)分別從有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣和無特異性表達(dá)基因的參照樣中提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,并構(gòu)建有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣的cD2NA文庫,再分別用有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣和無特異性表達(dá)基因的參照樣的cDNA探針與有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣cDNA文庫的菌落或噬菌斑作原位雜交,選出只與有特異性表達(dá)基因的目標(biāo)樣雜交的克隆,即為有特異性表

7、達(dá)基因的目標(biāo)樣特異表達(dá)的克隆.此技術(shù)要經(jīng)過多輪菌斑雜交,不僅費(fèi)力費(fèi)錢,重復(fù)性差,而且靈敏度低.1.3差異顯示PCR差異顯示PCR[2]是1992年由Liang報道的.此法的主要原理是由mRNA2PCR共同組成的,利用大多數(shù)真核細(xì)胞基因的mRNA結(jié)尾處有poly(A)結(jié)構(gòu),在其3′端設(shè)計5′poly(T)引物,該引物可與mRNA結(jié)合,從而使這部分的基因達(dá)到轉(zhuǎn)錄.然后從兩種不同類型的細(xì)胞中分離mRNA,作反轉(zhuǎn)錄,比較PCR產(chǎn)物后即可克隆目的基因.其具體操作為:用一套錨定引物反轉(zhuǎn)錄每一部分材料后,再分別用這一套錨定引

8、物和隨機(jī)引物從反轉(zhuǎn)錄的每一部分材料中擴(kuò)增cDNA,電泳分離產(chǎn)生擴(kuò)增片段后再擴(kuò)增兩種不同狀態(tài)下有差異的片段,并且進(jìn)行克隆和測序.如果采用同位素標(biāo)記的方法,在凝膠電泳或放射自顯影照片上就可發(fā)現(xiàn)不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物.該技術(shù)能快速地顯示細(xì)胞mRNA的組成,可對各樣本mRNA的差異同時進(jìn)行比較和展示,并且所用mRNA量少;可以立即對擴(kuò)增的cDNA進(jìn)行測序和克隆及與探針標(biāo)記、雜交和文庫篩選.它的缺點