《基因克隆載體》PPT課件

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1、3基因克隆載體定義通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。必備條件1、克隆位點(一個或多個)2、能攜帶外源DNA片段進入受體細胞:能自我復制，或整入染色體隨受體細胞DNA復制而復制。3、有選擇克隆子的標記基因4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉入別的,尤其人的細胞)意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構建新載體一直是基礎研究的優(yōu)先領域。按克隆載體的來源分：質?！《净蚴删w～質粒與病毒或噬菌體DNA組成的～質粒與染色體DNA片段組成的～按應用范圍分：表達型～啟動子探針型～cDNA

2、～按應用對象分：原核生物～植物～動物～分類３.１質?？寺≥d體定義：以質粒DNA為基礎構建而成的載體，適于原核和植物的基因轉移、建立基因組文庫和cDNA基因文庫。一、質粒適于載體構建的性質１、組成與構型是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細菌、真菌、藍藻、綠藻）構型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子大?。?00～102kb３、復制特點：在宿主細胞內；單向；質粒和宿主細胞雙重遺傳系統(tǒng)控制復制強度：拷貝數(shù)（細胞內質粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質粒在其宿主細胞內的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定嚴緊控制型：1~數(shù)個拷貝；大質粒松馳控制型：10個以上拷貝；小質粒

3、。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質粒大量擴增（如ColE1拷貝數(shù)達3000個）。（２）質粒復制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，當質粒復制到一定拷貝數(shù)時，阻遏物也合成積累，直到阻止質粒的繼續(xù)復制。rep基因：指令宿主合成一種調節(jié)蛋白，促進質粒的復制par序列：附著在細胞膜上，使質粒隨細胞分裂而正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)４、質粒的不親合性親和性質粒：能在同一細胞中復制的幾種質粒不親和性（不相容性）質粒：不能在同一細胞中復制的質粒意義：宿主細胞內的原有質粒與克隆載體的質粒必須是親和性質粒，最好不含內源性質粒５、質粒遷移（１）接合質粒：含

4、tra基因→合成細胞表面物質（鞭毛）→質粒DNA入受體細胞含tra基因的質粒稱為接合質粒。如F、Ti等不含tra基因的質粒稱為非接合質粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用不含tra基因而含bom（oriＴ）位點的質粒，當宿主細胞存在輔助質粒mob基因產(chǎn)物時，即可打開oriＴ位點，非結合質粒借助接合質粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細胞。這種現(xiàn)象稱～質粒的遷移作用６、顯性質粒和隱蔽質粒宿主因含某種質粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達型）質粒。顯性質粒Ｒ質粒：含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥物的抗性基因，可

5、作為選擇標記。Col質粒Ｆ質粒降解質粒Ｔi質粒隱蔽質粒藍藻內源質粒二、質粒克隆載體構建的基本策略１、能進行有效復制——復制起始位點（最好是多拷貝）２、克隆位點——組裝MCS連桿３、選擇標記基因——抗性基因，LacZ’基因４、分子盡可能?。ㄞD化率高），＞15kb，轉化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等三、質?？寺≥d體構建過程：嚴密的實驗設計→構建（切割、修飾和連接重組）構建原則1、選用合適的出發(fā)質粒：含必備的元件，如ori、選擇標記、克隆位點、啟動子和終止子2、正確獲得構建質?？寺≥d體的元件3、組裝合適的選擇標記基因4、選用合適的啟動子

6、5、構建過程力求簡單代表性實例。（一）pBR322及其衍生質?？寺≥d體的構建Ⅰ、pBR322構建質粒載體命名法則“pBR322”p：質粒（plasmid)BR：兩位主要構建者322：實驗編號pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴緊型ColE1松馳型，篩選系統(tǒng)復雜構建過程(出發(fā)質粒：pMB1)R1（沙門氏菌中分離）變異R1drd19（含易位子Tn3Apr）R1drd19Tn3pSF2124ColE1pBR322的三個親本：pMB1、pSF2124、pSC101識別位點：Apr基因區(qū)（3個）：PstⅠ、ScaⅠ、PvuⅠTcr基因區(qū)（7個）：B

7、amHⅠ、ScalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ、NheⅠ、NruⅠ、XmaⅢTcr啟動子區(qū)（2個）：ClaⅠ、HindⅢpBR322分子大?。?363bp3、優(yōu)點（1）較小的分子量10kb以內DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素擴培后達1000～3000copys/cell（3）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇標記。插入失活（圖解）Ⅱ、pUC18/19質粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個多克隆位點（MCS

8、）連桿命名pUC——UniversityofCalifornia的科學家首先構建。圖3-3。pUC包括四個組成部分：（1）pBR322的