《基因克隆載體》ppt課件

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1、基因克隆載體第一節(jié)　基因克隆載體的特點與分類1基因克隆載體的含義及特點含義：能夠把外源DNA片段帶入受體細胞并進行穩(wěn)定遺傳的DNA或RNA分子．MCSMarkerForeigngene基因克隆載體的特點特點:1）具備與外源DNA片段連接和重組的克隆位點．2）進入受體細胞后能穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中或與染色體整合在一起．3）在宿主細胞或受體細胞中自我復制或隨整合的受體細胞染色體DNA一起復制．4）外源基因能在受體細胞中表達．5）克隆載體進入細胞后有可供選擇標記２克隆載體的分類a)質(zhì)粒載體：大腸桿菌質(zhì)粒載體，枯草桿菌質(zhì)粒載體，酵母質(zhì)粒載體，農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體，藍細菌質(zhì)粒載體b)噬菌體載

2、體：雙鏈DNA噬菌體載體λ；單鏈DNA噬菌體載體，M13，T3，T7c)病毒載體：植物病毒載體CaMV（花椰菜花斑病病毒）；動物病毒載體SV40（猿猴空泡病毒）d)質(zhì)粒和噬菌體DNA兼有的載體：Phasmid載體（含有f1噬菌體的ori）；Cosmid載體（含有λDNA的Cos區(qū)）e)染色體和質(zhì)粒DNA兼有的載體（Chrosmidvector）基因整合平臺系統(tǒng)；ＹＡＣ克隆載體2.1按構建克隆載體DNA的來源分類2.2按克隆載體的用途分類a)cDNA克隆載體：λgt11，pT7T3，b)原核（Prokaryotic）表達載體：pKK223-3c)原核基因融合（Prokary

3、oticgenefusion）載體：pGEX-2T，pGEX-3Xd)真核（Eukaryotic）表達載體：pSVK3，pBPVe)轉(zhuǎn)錄（Transcription）載體：pSL1190f)普通載體（Generalvector）：pBR322，pUC18第二節(jié)質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒(plasmid)是一種存在于宿主細胞中染色體外裸露的雙鏈DNA分子．１質(zhì)粒載體的一般特性1）質(zhì)粒的組成與構型細胞內(nèi)：超螺旋環(huán)狀共價雙鏈DNA分子細胞外：超螺旋、開環(huán)，線形雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）質(zhì)粒DNA分子的大小:細菌質(zhì)粒的大小相差較大，小的僅不足1k

4、b，大的可達數(shù)百kb.不相容性（Incompatible）：兩種類似的但又不同的質(zhì)粒不能存在于同一細胞中．可轉(zhuǎn)移性：質(zhì)?？赏ㄟ^接合作用等方式轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞中．復制性：質(zhì)粒DNA分子只在宿主細胞內(nèi)進行單向復制，其復制受質(zhì)粒本身和宿主細胞遺傳系統(tǒng)的雙重控制，質(zhì)粒提供復制的起始位點和核苷酸的序列．質(zhì)粒載體的特性質(zhì)粒上的相關基因A）COP因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，在質(zhì)粒的復制過程中指令細胞合成阻物，當質(zhì)粒復制到一定的拷貝時，阻物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復制．B）Rep基因：在質(zhì)粒的復制過程中，Replication基因會指令宿主細胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制．C）Inc

5、基因：決定兩種親緣關系相近的兩種質(zhì)粒不能存在于同一宿主細胞中．D）Tra基因：指令宿主細胞合成菌毛（Pilus）和細胞表面物，促使宿主細胞與受體細胞表面結合，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）．G）降解基因：降解重金屬、有機物和農(nóng)藥等．H)致瘤基因：誘導某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒．２幾種常見的質(zhì)粒載體１）pBR322：pBR3224363優(yōu)點：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號。3、具有較高的

6、拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積1000-3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和復制的起始點，部分缺失的Lac操縱子片段，并在LacZ’區(qū)組裝了MCS．pUC18-19多克隆位點3）pBluescriptM13：含有M13噬菌體DNA復制起點的載　體，該起點以互為相反方向插入到含有T3和T7噬菌體啟動　子的一個來自pUC質(zhì)粒的載體當中．4）Ti質(zhì)粒載體人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。1907年Smith和Townsent等首先發(fā)現(xiàn)這

7、種冠癭瘤病是由根癌農(nóng)桿菌引發(fā)的。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與植物遺傳轉(zhuǎn)化1、T-DNA區(qū)：轉(zhuǎn)移DNA，農(nóng)桿菌侵染細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞上的一段DNA2、Vir區(qū)：毒區(qū)，激活T-DNA轉(zhuǎn)移。與T-DNA區(qū)相鄰，二者共占Ti質(zhì)粒DNA的1/3。3、Con區(qū)：接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)，該區(qū)存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。4、Ori區(qū)：復制起始區(qū)病毒區(qū)基因及功能Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列３質(zhì)粒載體的構建1）構建的質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)化受體細胞,并在其中進行松弛型復制.*選擇松弛型質(zhì)粒復制起始子(O