重組yegfp發(fā)光酵母細(xì)胞檢測牛尿中雌激素類藥物

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1、動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，２０１４，３５（１２）：６１－６４ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ重組ｙＥＧＦＰ發(fā)光酵母細(xì)胞檢測牛尿中雌激素類藥物達(dá)劍森１，２，李湘鳴３＊，劉宗平１＊（１．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州２２５００９；２．揚(yáng)州市邗江區(qū)畜牧獸醫(yī)站，江蘇揚(yáng)州２２５００２；３．揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州２２５００９）摘要：用重組人雌激素受體（ｈＥＲ）基因酵母細(xì)胞（Ｗ３０３－１Ａ／ｈＥＲ－ＥＲＥ－ｙＥＧＦＰ），分別對成年奶牛和犢牛尿樣的雌激素藥物殘留進(jìn)行檢測測定。該重組酵母細(xì)胞是一種發(fā)光酵母細(xì)胞，其發(fā)光度與雌激素化合物具有劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，成年奶

2、牛尿樣中的雌激素類化合物高于犢牛尿樣，分別為１．０００×１０－４和－５雌二醇當(dāng)量，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。本研究所建立的方法高效、快速、高通量，２．５１８×１０可用于牛尿樣中雌激素類藥物殘留分析。關(guān)鍵詞：１７β－雌二醇；重組基因ｙＥＧＦＰ發(fā)光酵母細(xì)胞；牛尿中圖分類號：Ｓ８５９．８４文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：１００７－５０３８（２０１４）１２－００６１－０４隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，消費(fèi)者對于畜產(chǎn)品器材有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水式真空泵（ＳＨＢ－ⅢＡ），鞏的質(zhì)量提出了更高的要求，越來越多的兒童性早熟、義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；超聲波清洗器激素水平異常

3、現(xiàn)象以及由于激素而導(dǎo)致的各類疾?。ǎ耍眩玻担埃拢?，南京國思源商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；電熱鼓的出現(xiàn)，使得人們對畜產(chǎn)品中激素種類與水平的關(guān)風(fēng)干燥箱（ＤＧＧ－９０７０Ｂ），上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公注日益密切。我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀（Ｓｙｎｅｒｇｙｚ），美國Ｂｉｏｔｅｋ儀器理局于２００２年３月２１日聯(lián)合發(fā)布公告，公布了《禁有限公司產(chǎn)品；干式氮吹儀（ＮＤＫ２００－２），上海皓莊止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》，其儀器有限公司產(chǎn)品。中有雌激素類藥物己烯雌酚、雌二醇、戊酸雌二醇、１．１．２試劑雌二醇（優(yōu)級純級），美國Ｍｅｒｃｈ公苯甲酸雌

4、二醇、氯烯雌醚、炔諾醇等。由于受經(jīng)濟(jì)利司產(chǎn)品；甲醇，乙腈、ＮａＡｃ、三氯甲烷均為國藥集團(tuán)［１］益驅(qū)使，為促進(jìn)畜禽生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率，某些化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇為上海蘇懿化學(xué)不法分子在畜禽養(yǎng)殖過程中違法使用雌激素類藥物試劑有限公司產(chǎn)品；重組基因酵母細(xì)胞（Ｗ３０３－１Ａ／屢禁不止，并且新的同類藥物不斷的出現(xiàn)，這種危害ｈＥＲ－ＥＲＥ－ｙＥＧＦＰ），揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院李湘鳴教授提有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢，將成為威脅動物和人類繁衍供；從揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場采集初生１０日齡犢牛尿液１１［２］生息的潛在危險(xiǎn)因素之一。本研究正是利用具有份和成年牛尿樣１０份，置－２０℃冷凍保存。特

5、定傳感器的重組基因綠色熒光蛋白（ｙＥＧＦＰ）酵母１．２方法細(xì)胞，對４月齡懷孕母牛和犢牛尿樣中雌激素類藥１．２．１樣品前處理用定性濾紙將尿液過濾至干物水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果報(bào)道如下。凈玻璃瓶中。?。玻恚膛Ｄ蛞悍謩e加入２０μＬ葡萄１材料與方法糖苷酶和硫酸酯酶使酶濃度為３Ｕ／ｍＬ，于３７℃水１．１材料浴過夜，進(jìn)行酶解，然后加入０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ２１．１．１主要儀器設(shè)備Ｃ１８固相萃取柱（ＬＣ－ｍＬ，使其ｐＨ為４．８，準(zhǔn)備用Ｃ１８吸附。陽性對照與Ｃ１８），德國ＣＮＷＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)尿樣陰性對照：隨機(jī)選取犢牛尿樣２ｍＬ，加入０．０５箱（Ｈ

6、ＷＳ－２５０），上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；ｍｍｏｌ／Ｌ１７β－雌二醇（Ｅ２）４０μＬ，作為陽性對照，另恒溫水浴鍋（ＨＨ－Ｓ４），南京新中惠科學(xué)器材有限公取２ｍＬ加入４０μＬ無水乙醇作為尿樣陰性對照，目司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋（ＬＳ－３０），上海博迅實(shí)業(yè)有限公的是進(jìn)行質(zhì)量控制，確定該方法的可靠性，同時(shí)取２司產(chǎn)品；恒溫振蕩器（ＳＫＹ－２１１Ｃ），南京新中惠科學(xué)ｍＬ雙蒸水作為試劑空白對照，其余操作同尿樣。收稿日期：２０１４－０７－１８基金項(xiàng)目：江蘇省揚(yáng)州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（ＹＺ２０１１０９２）作者簡介：達(dá)劍森（１９８２－），男，江蘇南通人，博士，主要從事臨床獸醫(yī)研究和動

7、物食品安全性評價(jià)。＊通訊作者６２動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展２０１４年第３５卷第１２期（總第２５８期）１．２．２吸附與洗脫將酶解過夜尿樣置于經(jīng)甲醇體積（２ｍＬ），Ｖ２為測試時(shí)所取尿樣的體積（２ｍＬ），［３］活化的５００ｍｇＣ１８柱進(jìn)行吸附，結(jié)束后用循環(huán)水Ｖ３為加入樣品洗脫液的體積（０．０１ｍＬ），Ｖ４為洗式真空泵抽氣５ｍｉｎ，盡量除去Ｃ１８柱中殘留的水脫液最后定容的體積。分，用乙腈洗脫Ｃ１８吸附柱２次，每次４ｍＬ，將洗脫２結(jié)果液洗收集于玻璃試管中，揮干，用乙腈定容至０．２２．１時(shí)間劑量效應(yīng)ｍＬ，此溶液１ｍＬ相當(dāng)于２０ｍＬ尿樣。封口編號，不同濃度的Ｅ２作用于Ｗ３０３－１Ａ／ｈ

8、ＥＲ－ＥＲＥ－冷凍備用。ｙＥＧＦＰ后，４ｈ時(shí)于１０－