金克對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和凋亡的影響

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1、金克對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和凋亡的影響【摘要】［目的］觀察金克（槐耳清膏）對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。［方法］以MCF?鄄7細(xì)胞復(fù)制裸鼠異種乳腺癌移植瘤模型，30只BALB/c荷瘤鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（15只）、金克組（15只）。分別用生理鹽水（0.2ml/只）和金克(0.2ml/只)連續(xù)灌胃30d，觀察各組的抑瘤效果及對(duì)裸鼠瘤體大小和生存時(shí)間的影響。采用光鏡、Tunel法行原位凋亡檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤凋亡的形態(tài)學(xué)變化。［結(jié)果］①金克組腫瘤體積大小明顯小于對(duì)照組（4.62±1.86cm3，6.35±2.73cm3，P<0.01）；②金

2、克組生存期為明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（116.7±28.5d，95.3±26.7d，P<0.01）；③原位凋亡檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）明顯金克組高于對(duì)照組，差異有顯著性（19.32%vs8.36%，P<0.01）；④流式細(xì)胞術(shù)顯示金克組凋亡比例與對(duì)照組差異有顯著性（18.21%vs8.39%，P<0.01）。［結(jié)論］金克可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF?鄄7移植瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生存期。【關(guān)鍵詞】金克乳腺腫瘤移植瘤凋亡金克—槐耳顆粒具有良好的促凋亡效果和免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用，無(wú)明顯毒副作用。對(duì)肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有獨(dú)特療效[1]。本文主要觀察金克對(duì)乳腺腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，對(duì)腫瘤

3、細(xì)胞凋亡的影響。1材料與方法1．1材料金克（槐耳清膏）由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供。人乳腺癌細(xì)胞株MCF?鄄7購(gòu)于上海生命科學(xué)院。細(xì)胞培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)液中，呈貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，每3～5天傳代1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性純種裸鼠，4~6周齡，體重12g~20g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（合格證號(hào)：SCXK(鄂)2003?鄄0005），飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。裸鼠置于恒溫層流箱中，于無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)，12h光照和12h黑夜交替。喂養(yǎng)符合衛(wèi)生部頒布的“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料標(biāo)準(zhǔn)”。1．2方法人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立

4、：人乳腺癌細(xì)胞株MCF?鄄7在含10％的胎牛血清及160U/L胰島素的RPMI?鄄1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液，活細(xì)胞濃度為1×107/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞占95％以上。SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.1ml/只（含細(xì)胞數(shù)約0.5×107個(gè)）[2,3]。動(dòng)物分組及用藥：接種4周后，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和金克組。①對(duì)照組：15只，采用灌胃法給藥，每天灌注0.9％生理鹽水0.2ml/只，共30d。②金克組15只，每天灌注藥物0.2ml/只，其濃度為150mg/ml，共30d。金克組藥物劑量相當(dāng)于人體正常服用金克劑量根據(jù)體表

5、面積比值進(jìn)行換算折合成裸鼠的劑量[4]。移植瘤生長(zhǎng)情況及藥物抑瘤效果：給藥后每隔3d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑（a）、橫徑（b）。計(jì)算移植瘤的體積＝（a×b2）/2[5]，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。移植瘤組織病理學(xué)觀察：取移植瘤用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。裸鼠主要臟器組織學(xué)觀察：將裸鼠的肝、肺固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察有無(wú)臟器轉(zhuǎn)移。生存期觀察：待各組裸鼠衰竭時(shí)處死或自然死亡，記錄死亡時(shí)間，按公式計(jì)算生命延長(zhǎng)率：生命延長(zhǎng)率（％）＝（金克組平均存活時(shí)間－對(duì)照組平均存活時(shí)間）/對(duì)照組平均存活時(shí)間×100％。凋亡指數(shù)（AI）：原位凋亡檢測(cè)Tun

6、el法熒光顯微鏡下初步分析，光鏡下避開(kāi)壞死區(qū)，選10個(gè)高倍視野（×400倍）凋亡典型區(qū)域，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比即為AI。流式細(xì)胞術(shù)：待裸鼠衰竭時(shí)處死或自然死亡，剝?nèi)∧[塊，用剪刀取部分瘤塊，將瘤組織剪碎，并用0.1MPBS液反復(fù)沖洗，用200目金屬網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液，離心后去掉上清液，再加入0.1MPBS液沖洗，再離心，去掉上清液，加入70％乙醇1ml，邊加邊振蕩。然后上流式細(xì)胞儀（FACScanBectonDickinson，美國(guó)），做細(xì)胞周期采樣分析，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡比例及主要作用細(xì)胞分裂的哪個(gè)周期。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS12.0

7、統(tǒng)計(jì)軟件處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況30只裸鼠皮下接種MCF?鄄7細(xì)胞懸液10d左右，于接種部位皮下均可觸及直徑約2mm～3mm的瘤塊，致瘤率100％。其后腫瘤逐漸長(zhǎng)大，28d后移植瘤長(zhǎng)徑長(zhǎng)至0.8cm左右，再分組給予不同的藥物處理，此后每3d檢測(cè)1次移植瘤最大長(zhǎng)徑和橫徑，計(jì)算移植瘤體積，裸鼠治療第30d移植瘤平均體積對(duì)照組為6.35±2.73cm3；金克組為4.62±1.86cm3，差異有顯著性（P<0.01）。顯