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1、金克對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和凋亡的影響【摘要】[目的]觀察金克(槐耳清膏)對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。[方法]以MCF?鄄7細(xì)胞復(fù)制裸鼠異種乳腺癌移植瘤模型,30只BALB/c荷瘤鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(15只)、金克組(15只)。分別用生理鹽水(0.2ml/只)和金克(0.2ml/只)連續(xù)灌胃30d,觀察各組的抑瘤效果及對(duì)裸鼠瘤體大小和生存時(shí)間的影響。采用光鏡、Tunel法行原位凋亡檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤凋亡的形態(tài)學(xué)變化。[結(jié)果]①金克組腫瘤體積大小明顯小于對(duì)照組(4.62±1.86cm3,6.35±2.73cm3,P<0.01);②金
2、克組生存期為明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(116.7±28.5d,95.3±26.7d,P<0.01);③原位凋亡檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)明顯金克組高于對(duì)照組,差異有顯著性(19.32%vs8.36%,P<0.01);④流式細(xì)胞術(shù)顯示金克組凋亡比例與對(duì)照組差異有顯著性(18.21%vs8.39%,P<0.01)。[結(jié)論]金克可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF?鄄7移植瘤生長(zhǎng),延長(zhǎng)生存期?!娟P(guān)鍵詞】金克乳腺腫瘤移植瘤凋亡金克—槐耳顆粒具有良好的促凋亡效果和免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用,無(wú)明顯毒副作用。對(duì)肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有獨(dú)特療效[1]。本文主要觀察金克對(duì)乳腺腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,對(duì)腫瘤
3、細(xì)胞凋亡的影響。1材料與方法1.1材料金克(槐耳清膏)由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供。人乳腺癌細(xì)胞株MCF?鄄7購(gòu)于上海生命科學(xué)院。細(xì)胞培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)液中,呈貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,每3~5天傳代1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雌性純種裸鼠,4~6周齡,體重12g~20g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(合格證號(hào):SCXK(鄂)2003?鄄0005),飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。裸鼠置于恒溫層流箱中,于無(wú)特定病原體(SPF)環(huán)境下飼養(yǎng),12h光照和12h黑夜交替。喂養(yǎng)符合衛(wèi)生部頒布的“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料標(biāo)準(zhǔn)”。1.2方法人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立
4、:人乳腺癌細(xì)胞株MCF?鄄7在含10%的胎牛血清及160U/L胰島素的RPMI?鄄1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),傳代擴(kuò)增,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備懸液,活細(xì)胞濃度為1×107/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞占95%以上。SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,在每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.1ml/只(含細(xì)胞數(shù)約0.5×107個(gè))[2,3]。動(dòng)物分組及用藥:接種4周后,將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和金克組。①對(duì)照組:15只,采用灌胃法給藥,每天灌注0.9%生理鹽水0.2ml/只,共30d。②金克組15只,每天灌注藥物0.2ml/只,其濃度為150mg/ml,共30d。金克組藥物劑量相當(dāng)于人體正常服用金克劑量根據(jù)體表
5、面積比值進(jìn)行換算折合成裸鼠的劑量[4]。移植瘤生長(zhǎng)情況及藥物抑瘤效果:給藥后每隔3d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑(a)、橫徑(b)。計(jì)算移植瘤的體積=(a×b2)/2[5],繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。移植瘤組織病理學(xué)觀察:取移植瘤用4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡觀察。裸鼠主要臟器組織學(xué)觀察:將裸鼠的肝、肺固定,石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察有無(wú)臟器轉(zhuǎn)移。生存期觀察:待各組裸鼠衰竭時(shí)處死或自然死亡,記錄死亡時(shí)間,按公式計(jì)算生命延長(zhǎng)率:生命延長(zhǎng)率(%)=(金克組平均存活時(shí)間-對(duì)照組平均存活時(shí)間)/對(duì)照組平均存活時(shí)間×100%。凋亡指數(shù)(AI):原位凋亡檢測(cè)Tun
6、el法熒光顯微鏡下初步分析,光鏡下避開(kāi)壞死區(qū),選10個(gè)高倍視野(×400倍)凋亡典型區(qū)域,計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比即為AI。流式細(xì)胞術(shù):待裸鼠衰竭時(shí)處死或自然死亡,剝?nèi)∧[塊,用剪刀取部分瘤塊,將瘤組織剪碎,并用0.1MPBS液反復(fù)沖洗,用200目金屬網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液,離心后去掉上清液,再加入0.1MPBS液沖洗,再離心,去掉上清液,加入70%乙醇1ml,邊加邊振蕩。然后上流式細(xì)胞儀(FACScanBectonDickinson,美國(guó)),做細(xì)胞周期采樣分析,檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡比例及主要作用細(xì)胞分裂的哪個(gè)周期。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS12.0
7、統(tǒng)計(jì)軟件處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況30只裸鼠皮下接種MCF?鄄7細(xì)胞懸液10d左右,于接種部位皮下均可觸及直徑約2mm~3mm的瘤塊,致瘤率100%。其后腫瘤逐漸長(zhǎng)大,28d后移植瘤長(zhǎng)徑長(zhǎng)至0.8cm左右,再分組給予不同的藥物處理,此后每3d檢測(cè)1次移植瘤最大長(zhǎng)徑和橫徑,計(jì)算移植瘤體積,裸鼠治療第30d移植瘤平均體積對(duì)照組為6.35±2.73cm3;金克組為4.62±1.86cm3,差異有顯著性(P<0.01)。顯