獨一味對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)軟骨影響的實驗研究

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1、湖北中醫(yī)藥大學博士學位論文獨一味對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)軟骨影響的實驗研究姓名：湛梅圣申請學位級別：博士專業(yè)：中醫(yī)骨傷科學指導教師：鄒季20120320中文摘要目的探討藏藥獨一味對兔KOA模型軟骨退變的保護或治療機制，為臨床獨一味防治骨關節(jié)炎的推廣應用提供理論支持。方法將4o只新西蘭大白兔隨機編號，分為五組，即，(A)空白對照組、(B)模型對照組、(C)小劑量組治療組、(D)中劑量組治療組、(”大劑量組治療組，每組8只。A組作為空白對照組，行模擬手術。B、C、D、E組按Hulth方法，制造兔膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型。術后1周開始全部實驗動物每天驅趕行走30min，于造模1周后開

2、始灌胃，各治療組給藥劑量根據Meeh-Rubner公式計算，將按體表面積折算的臨床常用量等效劑量，溶于10mL蒸餾水中，獨一味小劑量治療組、中劑量治療組和大劑量治療組分別灌胃給予獨一味膠囊60mg／kg、120mg／kg、240mg／kg。每天灌胃給藥一次；空白對照組、模型對照組于同一時間點給予等量生理鹽水灌胃。治療6周，末次給藥后禁食12h。處死動物。再用組織學、免疫組化、RT-PCR學等技術對兔KOA模型關節(jié)軟骨、關節(jié)液等部位進行檢測和評估。切開實驗側兔膝關節(jié)，對兔膝關節(jié)關節(jié)軟骨行大體觀察并參照文獻標準進行評分，比較各組間的差異；將關節(jié)軟骨制作成普通光學顯微鏡切片

3、進行觀察，并按照Mankin’s關節(jié)軟骨組織學評分系統(tǒng)進行評分，比較各組間的差異；制作透射電子顯微鏡切片，觀察其超微病理變化。在切開膝關節(jié)之前抽取關節(jié)液，檢測關節(jié)液中IL-1D、NO的含量變化，比較各組間的差異；應用RT-PCR技術檢測藥物治療后，關節(jié)軟骨ⅢP-3，ⅢP一13，TIMP-ImRNA表達的變化，比較各組間的差異；用免疫組化法分別測量關節(jié)軟骨組織GAG含量、Ⅱ型膠原陽性染色面積的變化，并比較各組間的差異；結果給藥前后體重變化：與給藥前動物體重相比較，各劑量治療組在實驗結束時體重均有不同程度的增加，但無統(tǒng)計學差異(均為P>0．05)。關節(jié)活動度：實驗動物關節(jié)

4、被動活動度測定結果顯示，實驗6周時，模型對照組與小劑量治療組相比，P<0．05。各治療組關節(jié)活動度均有不同程度的恢復，獨一味中劑量、大劑量治療組恢復程度尤為明顯(P<0．01)。大體觀察，中、大劑量治療組與模型對照組比較，軟骨磨損、退變程度明顯減輕(P<0．01)，光鏡下觀察，治療組與模型對照組比較，Mankin’s評分明顯降低，小劑量治療組與模型對照組比較，P<0．05；中劑量、大劑量治療組與模型對照組比較，P<0．01；電鏡觀察發(fā)現，藥物治療后中、大劑量治療組關節(jié)軟骨細胞的形態(tài)、結構、排列等均優(yōu)于模型對照組。經不同劑量獨一味治療后，各組關節(jié)液中的NO、IL-16含

5、量均值相對于模型對照組有所降低，各治療組間進行比較，中、大劑量治療組關節(jié)液中NO、IL-1D含量與模型對照組比較明顯降低，比較有顯著性差異(P<0．01)。小劑量治療組與模型對照組比較，經檢驗，P<0．05；提示隨著獨一味劑量的增大，關節(jié)液中NO、IL一1D含量進一步降低。治療后，中、大劑量治療組與模型對照組比較，中、大劑量治療組MMP-3，塒P一13的mRNA表達較低、而TIMP-1的mRNA表達較高；模型對照組關節(jié)軟骨中MMP-3，刪P一13的mRNA表達明顯增高，而TIMP-1表達明顯降低。組間比較有顯著性差異(P

6、性染色顯著減少，分布不均勻，且表淺層出現缺損；經獨一味膠囊治療后，中、大劑量治療組與模型對照組比較，中、大劑量治療組Ⅱ型膠原陽性染色面積明顯增大，比較有顯著性差異(P<0．01)。檢測軟骨基質中GAG含量，模型組與小劑量治療組比較，軟骨基質中GAG含量有顯著性差異，P<0．05；中劑量組治療組、高劑量組治療組與模型組分別比較，中、高劑量治療組軟骨基質中GAG含量有顯著性差異，P<0．01；¨結論1．Hulth手術方法建立家兔膝OA模型，穩(wěn)定性好，成功率高，誘導周期較短，重復性好。2．獨一味通過減少兔膝OA模型關節(jié)液中NO、IL-1D含量，抑制MMPs表達，增加TIMP

7、一1表達，提高ECM中GAG含量，促進Ⅱ型膠原的合成，延緩或一定程度上能夠阻止兔膝oA病變過程的發(fā)展，進而改善兔膝OA關節(jié)功能。3．獨一味膠囊對骨性關節(jié)炎的治療機制可能與這幾方面有關：在兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型上，經不同劑量獨一味治療后，能增加模型OA關節(jié)的關節(jié)活動度，減輕或延緩軟骨退變、磨損程度和減少關節(jié)周圍軟骨性骨贅的增生，降低關節(jié)軟骨光鏡下的Mankin’s評分，中、高劑量治療組表現尤為明顯。應用獨一味干預oA關節(jié)模型后，經檢測關節(jié)液中的No、IL一1移含量明顯降低，表明獨一味膠囊通過降低OA關節(jié)局部IL一1D、NO的水平，減輕關節(jié)滑液和滑膜的炎