獨(dú)一味對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨影響的實(shí)驗(yàn)研究

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1、湖北中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文獨(dú)一味對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨影響的實(shí)驗(yàn)研究姓名：湛梅圣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：中醫(yī)骨傷科學(xué)指導(dǎo)教師：鄒季20120320中文摘要目的探討藏藥獨(dú)一味對(duì)兔KOA模型軟骨退變的保護(hù)或治療機(jī)制，為臨床獨(dú)一味防治骨關(guān)節(jié)炎的推廣應(yīng)用提供理論支持。方法將4o只新西蘭大白兔隨機(jī)編號(hào)，分為五組，即，(A)空白對(duì)照組、(B)模型對(duì)照組、(C)小劑量組治療組、(D)中劑量組治療組、(”大劑量組治療組，每組8只。A組作為空白對(duì)照組，行模擬手術(shù)。B、C、D、E組按Hulth方法，制造兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后1周開(kāi)始全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天驅(qū)趕行走30min，于造模1周后開(kāi)

2、始灌胃，各治療組給藥劑量根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算，將按體表面積折算的臨床常用量等效劑量，溶于10mL蒸餾水中，獨(dú)一味小劑量治療組、中劑量治療組和大劑量治療組分別灌胃給予獨(dú)一味膠囊60mg／kg、120mg／kg、240mg／kg。每天灌胃給藥一次；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組于同一時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。治療6周，末次給藥后禁食12h。處死動(dòng)物。再用組織學(xué)、免疫組化、RT-PCR學(xué)等技術(shù)對(duì)兔KOA模型關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)液等部位進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。切開(kāi)實(shí)驗(yàn)側(cè)兔膝關(guān)節(jié)，對(duì)兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察并參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，比較各組間的差異；將關(guān)節(jié)軟骨制作成普通光學(xué)顯微鏡切片

3、進(jìn)行觀察，并按照Mankin’s關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分，比較各組間的差異；制作透射電子顯微鏡切片，觀察其超微病理變化。在切開(kāi)膝關(guān)節(jié)之前抽取關(guān)節(jié)液，檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IL-1D、NO的含量變化，比較各組間的差異；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)藥物治療后，關(guān)節(jié)軟骨ⅢP-3，ⅢP一13，TIMP-ImRNA表達(dá)的變化，比較各組間的差異；用免疫組化法分別測(cè)量關(guān)節(jié)軟骨組織GAG含量、Ⅱ型膠原陽(yáng)性染色面積的變化，并比較各組間的差異；結(jié)果給藥前后體重變化：與給藥前動(dòng)物體重相比較，各劑量治療組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重均有不同程度的增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P>0．05)。關(guān)節(jié)活動(dòng)度：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)

4、被動(dòng)活動(dòng)度測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)6周時(shí)，模型對(duì)照組與小劑量治療組相比，P<0．05。各治療組關(guān)節(jié)活動(dòng)度均有不同程度的恢復(fù)，獨(dú)一味中劑量、大劑量治療組恢復(fù)程度尤為明顯(P<0．01)。大體觀察，中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較，軟骨磨損、退變程度明顯減輕(P<0．01)，光鏡下觀察，治療組與模型對(duì)照組比較，Mankin’s評(píng)分明顯降低，小劑量治療組與模型對(duì)照組比較，P<0．05；中劑量、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較，P<0．01；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，藥物治療后中、大劑量治療組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列等均優(yōu)于模型對(duì)照組。經(jīng)不同劑量獨(dú)一味治療后，各組關(guān)節(jié)液中的NO、IL-16含

5、量均值相對(duì)于模型對(duì)照組有所降低，各治療組間進(jìn)行比較，中、大劑量治療組關(guān)節(jié)液中NO、IL-1D含量與模型對(duì)照組比較明顯降低，比較有顯著性差異(P<0．01)。小劑量治療組與模型對(duì)照組比較，經(jīng)檢驗(yàn)，P<0．05；提示隨著獨(dú)一味劑量的增大，關(guān)節(jié)液中NO、IL一1D含量進(jìn)一步降低。治療后，中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較，中、大劑量治療組MMP-3，塒P一13的mRNA表達(dá)較低、而TIMP-1的mRNA表達(dá)較高；模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3，刪P一13的mRNA表達(dá)明顯增高，而TIMP-1表達(dá)明顯降低。組間比較有顯著性差異(P

6、性染色顯著減少，分布不均勻，且表淺層出現(xiàn)缺損；經(jīng)獨(dú)一味膠囊治療后，中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較，中、大劑量治療組Ⅱ型膠原陽(yáng)性染色面積明顯增大，比較有顯著性差異(P<0．01)。檢測(cè)軟骨基質(zhì)中GAG含量，模型組與小劑量治療組比較，軟骨基質(zhì)中GAG含量有顯著性差異，P<0．05；中劑量組治療組、高劑量組治療組與模型組分別比較，中、高劑量治療組軟骨基質(zhì)中GAG含量有顯著性差異，P<0．01；¨結(jié)論1．Hulth手術(shù)方法建立家兔膝OA模型，穩(wěn)定性好，成功率高，誘導(dǎo)周期較短，重復(fù)性好。2．獨(dú)一味通過(guò)減少兔膝OA模型關(guān)節(jié)液中NO、IL-1D含量，抑制MMPs表達(dá)，增加TIMP

7、一1表達(dá)，提高ECM中GAG含量，促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成，延緩或一定程度上能夠阻止兔膝oA病變過(guò)程的發(fā)展，進(jìn)而改善兔膝OA關(guān)節(jié)功能。3．獨(dú)一味膠囊對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制可能與這幾方面有關(guān)：在兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型上，經(jīng)不同劑量獨(dú)一味治療后，能增加模型OA關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)活動(dòng)度，減輕或延緩軟骨退變、磨損程度和減少關(guān)節(jié)周?chē)浌切怨琴樀脑錾?，降低關(guān)節(jié)軟骨光鏡下的Mankin’s評(píng)分，中、高劑量治療組表現(xiàn)尤為明顯。應(yīng)用獨(dú)一味干預(yù)oA關(guān)節(jié)模型后，經(jīng)檢測(cè)關(guān)節(jié)液中的No、IL一1移含量明顯降低，表明獨(dú)一味膠囊通過(guò)降低OA關(guān)節(jié)局部IL一1D、NO的水平，減輕關(guān)節(jié)滑液和滑膜的炎