豬stra8基因的克隆、表達和體外轉染精原干細胞的初步研究

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1、何慶玲豬Stra8基因的克隆、表達和體外轉染精原干細胞的初步研究豬Stra8基因的克隆、表達和體外轉染精原干細胞的初步研究研究生：何慶玲專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖導師：李碧春教授(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009)摘要精子發(fā)生的場所在雄性動物睪丸的曲細精管內，精子由原始精原干細胞經(jīng)過復雜的精子發(fā)生過程而最終形成。這個過程主要包括三個階段，首先是精原干細胞經(jīng)過有絲分裂大量增殖成為初級精母細胞。其次，初級精母細胞啟動減數(shù)分裂形成圓形的精子細胞。最后，精子細胞通過復雜的變態(tài)過程形成完整形態(tài)的精子。其中減數(shù)分裂是生殖細胞

2、特有的方式，是精子發(fā)生過程的重要環(huán)節(jié)。生殖細胞減數(shù)分裂的啟動與視黃酸(retinoicacid，RA)和其誘導的Stra8(stimulatedbyretinoicacidgene8)基因的表達密切相關。視黃酸(retinoicacid，RA)是維生素A在體內代謝后的主要活性物質。雄性胚胎睪丸的RA活性較低，無Stra8基因的表達使得雄性生殖細胞停留在有絲分裂階段。外源的RA能夠促進體外培養(yǎng)的雄性生殖細胞表達Stra8基因啟動減數(shù)分裂。雄性動物出生后，Stra8基因的表達啟動雄性生殖細胞開始減數(shù)分裂，從而進入精子發(fā)生的階段。公

3、豬睪丸精原細胞減數(shù)分裂的啟動即意味著首次生精波的啟動。不同豬種的精子生成時間有較大的差異。因此減數(shù)分裂啟動時間的早晚對于種公豬的飼養(yǎng)具有重要的經(jīng)濟意義。為了研究Stra8基因在減數(shù)分裂啟動的功能，本試驗對豬Stra8基因cDNA序列進行克隆，并以梅山豬作為試驗動物，研究其在豬的各個組織的表達情況，并構建基于EGFP的表達載體，研究其在精原干細胞體外培養(yǎng)過程中的功能，結果如下：1．Stra8基因cDNA全序列克隆。通過克隆Stra8基因的部分序列，用于設計5’RACE和3’RACE的特異性引物，采用PCR方法克隆出Stra8基因

4、的cDNA全序列，將該序列遞交Genbank，序列號為JQ965783，將全長為1444bp的全序列遞交NCBI的ORFFinder，發(fā)現(xiàn)該序列包含147bp的5’端，110lbp的CDS和196bp的3’端，有完整的PolyA尾，但未發(fā)現(xiàn)加尾信號AATAAA。編碼區(qū)編碼367個氨基酸，Stra8編碼氨基酸一級結揚州大學碩士學位論文構表明該蛋白質的相對分子量約為41．04kDa，理論等電點約為4．59。進一步對Stra8基因所編碼的氨基酸進行相關生物信息學預測，通過預測發(fā)現(xiàn)在所編碼氨基酸序列第3、4和301氨基酸殘基處存在3個

5、O．糖基化位點，第9和116位氨基酸處存在2個N．糖基化位點，并且發(fā)現(xiàn)13個絲氨酸、6個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點。在NCBI的BlastP搜索與豬Stra8基因編碼氨基酸同源的序列，分析Stra8基因編碼氨基酸與其他動物Stra8基因CDS閱讀框的同源性，豬與小鼠的同源性最高達78．4％，與雞的同源性最低，僅為45．4％。2．梅山豬Stra8基因時空表達譜的構建。在mRNA水平上，構建Stra8基因的組織表達譜，Stra8基因是一個組織特異性表達的基因，只在公豬的睪丸中表達，而在腦、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎和卵巢等

6、組織中均無表達。對不同時間段梅山豬睪丸組織Stra8基因的表達量進行熒光定量PCR分析，結果顯示Stra8基因的表達量隨著梅山豬日齡的變化呈現(xiàn)出上升的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學分析Stra8基因在初生、30、60、90及150日齡梅山豬睪丸中睪丸的表達量分別為O．05、0．16、O．5、0．6t和1，并且存在著一定的差異，且在150d表達量達到最高。毒3．Stra8基因真核表達載體的檬建和亞細胞定位。采用RT-PCR方法，以成年梅要山豬睪丸總RNA為模板擴增s艦8藩因的全長eDNA編碼區(qū)序列，采用TA克隆技～￡術，將目的片段插入到pMDl

7、9．T載體中，重組的質粒命名為pMDl9．T-Stra8，測序鑒定后，再將其CDS序列插入真核表達載體pEGFP．N1中，重組質粒命名為pEGFP-N1．Stra8，將其轉化到體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞中進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)Stra8蛋白分布在細胞質內，細胞核內無熒光，說明Stra8蛋白屬于細胞質表達的蛋白。4．Stra8轉染豬精原干細胞表達的初步研究。通過體外培養(yǎng)豬精原干細胞，將重組質粒pEGFP．N1．Stra8轉染豬第三代的精原干細胞，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與重組載體轉染NIH．3T3的結果不同的是，該基因所編碼的蛋白在

8、豬精原干細胞的細胞質和細胞核內都可見表達，推測其在減數(shù)分裂中行使轉錄因子的功能。關鍵詞：豬；Stra8；基因克??；表達分析；精原干細胞；何慶玲豬Stra8基因的克隆、表達和體外轉染精原干細胞的初步研究IIlPreliminaryStudyonCloningandEpressi