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1、分類號(hào)：R617密級(jí)：公開學(xué)校代碼：11065學(xué)號(hào)：Y0115130083專業(yè)博士學(xué)位論文干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3在肝臟缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制研究作者姓名關(guān)鴿指導(dǎo)教師臧運(yùn)金教授專業(yè)領(lǐng)域外科學(xué)（肝膽血管外）培養(yǎng)單位醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系答辯日期2018年5月16日干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3在肝臟缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制研究摘要研究背景及目的：肝臟缺血再灌注損傷(hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI)，是部分肝切除術(shù)、肝臟移植手術(shù)過程中常見的病理生理學(xué)現(xiàn)象，對(duì)手術(shù)的成功率和預(yù)后有重要的影響。盡管目前有關(guān)肝臟缺血再灌注損傷的相關(guān)機(jī)制研究取得了長足
2、的進(jìn)步，但其具體分子機(jī)制尚未得到完全闡明。干擾素（interferon，IFN）是一類細(xì)胞因子，在機(jī)體固有免疫和調(diào)節(jié)性免疫過程中有重要作用，主要是通過調(diào)節(jié)Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號(hào)通路并促進(jìn)干擾素誘導(dǎo)基因（IFN-stimulatedgenes，ISGs）的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。干擾素誘導(dǎo)基因，是由干擾素誘導(dǎo)的具有三角形四鈦重復(fù)段的蛋白（Interferon-inducedproteinswithtetratricopeptiderepeats，IFIT）。干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3，又叫維甲酸誘導(dǎo)基因G（Retinoicacid-inducedG，Rig
3、-G），被證明能夠產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，也能夠通過調(diào)節(jié)免疫T細(xì)胞的增殖從而參與機(jī)體的免疫反應(yīng)和進(jìn)程。有報(bào)道稱肝臟缺血再灌注損傷與I型干擾素信號(hào)通路密切相關(guān)，而IFIT3能反饋激活I(lǐng)型干擾素信號(hào)通路，但還沒有相關(guān)報(bào)道研究IFIT3在肝臟缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制。本研究目的在于：①探討IFIT3在肝臟缺血再灌注損傷中的作用和分子機(jī)制；②尋找肝臟缺血再灌注損傷可能存在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。研究方法：①隨機(jī)選取40例在青島大學(xué)附屬醫(yī)院器官移植中心進(jìn)行肝移植手術(shù)的患者，于生物標(biāo)本庫中獲取其供肝開放前后的肝組織標(biāo)本，采集其術(shù)后第一次肝功能和血凝常規(guī)結(jié)果。檢測供肝開放前后肝組織中IFIT3的表
4、達(dá)情況，分析其與患者術(shù)后谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanineaminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartatetransaminase，AST）數(shù)值的相關(guān)性。將40例病人分為IFIT3高表達(dá)組和低表達(dá)組，兩組行肝功能和血凝常規(guī)重要數(shù)據(jù)的比較分析。②將C57/B6小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組開腹后夾閉肝門血管，60min后去除血管夾，恢復(fù)肝臟血流，建立肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）的小鼠模型。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)驗(yàn)組，但不夾閉肝門血管。24h后處死小鼠，下腔靜脈取血，并切取肝左葉。小鼠肝臟做病理切片和HE染色并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估和壞死區(qū)域的對(duì)比。檢測兩組小鼠血清中ALT和
5、AST的水平并進(jìn)行分析，檢測兩組小鼠肝臟中IFIT3mRNA和蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行分析。將C57/B6小鼠分為三組，第一組（對(duì)照組）小鼠只進(jìn)行開腹和關(guān)腹手術(shù)；第二組（實(shí)驗(yàn)組，siNC組）小鼠在尾靜脈注射siNC慢病毒（無關(guān)基因敲低）的基礎(chǔ)上建立HIRI的小鼠模型；第三組（實(shí)驗(yàn)組，siIFIT3組）小鼠在尾靜脈注射siIFIT3慢病毒（靶I向敲低IFIT3）的基礎(chǔ)上建立HIRI的小鼠模型。獲取小鼠的肝組織及血液標(biāo)本。檢測三組小鼠肝臟中IFIT3mRNA的表達(dá)水平并進(jìn)行分析；小鼠肝臟進(jìn)行病理切片和HE染色，三組小鼠進(jìn)行壞死區(qū)域比較和面積的計(jì)算并進(jìn)行分析；檢測三組小鼠血清中ALT和AS
6、T的水平并進(jìn)行分析；檢測三組小鼠肝臟組織中，炎癥因子白介素1β(IL-1β)、白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α(TNFα)mRNA和蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行分析。③選取小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞株RAW246.7細(xì)胞，利用礦物油來構(gòu)建缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧（hypoxiareoxyg，HR）細(xì)胞模型。設(shè)置三組細(xì)胞，第一組（對(duì)照組）不進(jìn)行任何處理；第二組（實(shí)驗(yàn)組，siNC組）在用siNC慢病毒（無關(guān)基因敲低）轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上建立HR細(xì)胞模型；第三組（實(shí)驗(yàn)組，siIFIT3組）在用siIFIT3慢病毒（靶向敲低IFIT3）轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上建立HR細(xì)胞模型。檢測三組細(xì)胞中IFIT3mRNA和蛋白的表達(dá)水平并
7、進(jìn)行分析，分別檢測三組細(xì)胞和細(xì)胞上清中，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA和蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行分析。④照上述實(shí)驗(yàn)方法，再次構(gòu)建小鼠模型和細(xì)胞模型。小鼠模型中，檢測肝臟中干擾素信號(hào)通路誘導(dǎo)基因MX1、CXCL10和ISG15mRNA的表達(dá)水平并進(jìn)行分析；細(xì)胞模型中，檢測細(xì)胞中MX1、CXCL10和ISG15mRNA的表達(dá)水平并進(jìn)行分析。結(jié)果：①在選取的40例肝移植患者中，缺血再灌注后肝組織標(biāo)本中IFIT3的表達(dá)水平明顯高于再灌注之前IFIT3的表達(dá)水平（P<0.001
