組織因子在人胚胎干細胞誘導分化過程中表達及調(diào)控的研究

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1、萬方數(shù)據(jù)中圖分類號UDCR孓r(nóng)610博士學位論文學校代碼10553組織因子在人胚胎千細胞誘導分化過程中表達及調(diào)控的研究TheexpressionandregulationofTissueFactor(TF)duringhumanemblVOnicstemceUdif氨erentiationdUrlngnUmanemDlyOnlCStemCe兒nlIIerenIlaⅡ0n作者姓名：俞妍慧學科專業(yè)：臨床醫(yī)學研究方向：血栓與止血學院(系、所)：湘雅醫(yī)院指導教師：陳方平教授論文答辯日期壟!!：!!：蘭；答辯委員會主席蘭生!叢中南

2、大學二0一三年十一月萬方數(shù)據(jù)原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：么社曰期：盟年衛(wèi)月與日學位論文版權使用授權書本人了解中南大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留學位論文并根據(jù)國家或湖南省有關部門規(guī)定送交學位論文，允許學位論文被查閱和借閱；

3、學校可以公布學位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡向社會公眾提供信息服務。作者簽名：罅導師簽名鷴魄迎年衛(wèi)月與日萬方數(shù)據(jù)本課題基金資助>國家自然科學基金(項目批準號：81170477)>中央高?；究蒲袠I(yè)務費(項目批準號：2011QNzTl51)>教育部博士點基金(項目批準號：201101621200lo)萬方數(shù)據(jù)博士學位論文中文摘要組織因子在人胚胎干細胞誘導分化過程中表達及調(diào)控的研究摘要在機體的發(fā)育過程中，

4、基因的表達受到精確的調(diào)控。這種調(diào)控使基因按照機體發(fā)育的需要，表達呈現(xiàn)出特異的時間和空間特異性。近年來基因與蛋白的特異性表達已經(jīng)成為發(fā)育生物學中的研究熱點。組織因子(Tissuef．a(chǎn)ctor’TF)，又稱為凝血因子III、CDl42，是由263個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達，其在許多重要的生理及病理情況下，特別是維持機體凝血平衡和保護重要臟器方面具有重要作用。血栓與止血平衡是發(fā)育過程中最重要的穩(wěn)態(tài)之一。在血細胞形成之前，由滋養(yǎng)層細胞(Trophoblast)表達的大量TF使胚胎穩(wěn)定，在防止流產(chǎn)和妊娠大出

5、血方面有重要意義。在血細胞形成后，TF在不同的血細胞中表達水平不同，其具體調(diào)控機制目前尚未明確。人胚胎干細胞(hlIllanemb巧onicstemcells，11ESCs)由于其維持自我干細胞特性及多向分化潛能的特性，成為我們研究基因時間和空間特異性表達的良好模型。miRNA是一類約17．24個堿基的非編碼單鏈小分子IⅢA?，F(xiàn)在已知miRNAs這些微小的砌叮As控制著許多重要的生理或病理過程。而Akt和Erkl／2在包括發(fā)育、細胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用。在本實驗中我們以人類胚胎干細胞為體外模型，分化成造血

6、細胞及滋養(yǎng)層細胞，檢測不同分化階段細胞中TF的表達水平的變化。并lIl萬方數(shù)據(jù)博士學位論文中文摘要進一步探討在分化過程中，miI州A及Erkl／2對TF表達的調(diào)控。本研究分為以下三個部分：第一部分組織因子在人胚胎干細胞分化過程中的表達變化目的建立有效的人胚胎干細胞向造血細胞及滋養(yǎng)層細胞誘導分化體系，為后續(xù)實驗提供可靠地細胞標本。檢測分化過程中不同階段TF的表達水平。方法①將人胚胎干細胞(艟SCs)誘導分化出造血干／祖細胞(hematopoieticstem／progenitorcells，HSPCs)及滋養(yǎng)層細胞；②將造

7、血干／祖細胞分化為粒．單細胞及紅細胞；③流式細胞學檢測造血細胞特異性標記，肌PCR檢測滋養(yǎng)層細胞特異性標記；④磁珠分選CD34+，或CDl4+，或CDl5+細胞，檢測TF(CDl42)表達水平；⑤qPCR，R1乙PCR及WeStemblot檢測TF的mRNA及蛋白水平的表達。結果①人胚胎干細胞(11ESCs)與小鼠骨髓基質(zhì)細胞(0P9)共培養(yǎng)第8天，流式細胞學檢測CD34+細胞比例達到17．2％，磁珠分選后，流式細胞學檢測TF表達為陰性；②添加不同細胞因子組合誘導粒．單細胞及紅細胞，磁珠分選后檢測TF表達，發(fā)現(xiàn)粒．單細胞

8、TF表達呈陽性，紅細胞TF表達呈陰性；③RT-PCR檢測BMP4方法誘導分化第0天、第2天、第5天的滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)第0天可見OCT-4、Nanog表達；培養(yǎng)第5天可見滋養(yǎng)層特異性基因CDx2表達，TF表達：④粒．單細胞和滋養(yǎng)層細胞TF的m砌蛆和蛋白水平有表達，而人胚胎干細胞、造血干／祖細胞、紅細胞TF不表達。結論我