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《多重PCR檢測豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒的研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、黑龍江八一農(nóng)墾大學碩士學位論文多重PCR檢測豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒的研究姓名:劉建柱申請學位級別:碩士專業(yè):預防獸醫(yī)學指導教師:樸范澤2003.6.1縮寫詞CSFClassicalSwineFeverCSFVClassicalSwineFeverVimsPPVPorcineParvovirusPRPorcinepseudombiesPRVPorcinepseudombiesvirusFAfluorescentantibodyENDExaltationofNDVRTReverseTranscriptionPCRPolymeraseChainReactionAMVase
2、ReverseTraanscriptasefromAvianMyeloblastosisVirus豬瘟豬瘟病毒豬細小病毒·豬偽狂犬病豬偽狂犬病毒熒光抗體試驗雞新城疫病毒強化實驗反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應一種來自禽腦脊髓炎病毒的反轉(zhuǎn)錄酶SNserumneutralization血清中和試驗IliAindirecthemagglutination間接血凝試驗CTB--ELISAcomplextrappingblackingELISA復合捕捉封閉ELISAAC--ELISAantigen-.capture---ELISA抗原捕獲ELISAC.ELlSAcompetitiveenzyme·lin
3、kedimmunosorbentassay競爭ELlSADot.ELISA斑點.ELISAHAorHIhemagglutinationorHA.inhibition血凝(抑制)試驗CIEcountercurl'entimmunoelectrophoresis對流免疫電泳試驗LATlatexagglutinationtestt乳膠凝集試驗SECGASilver-enhancedcolloidalgoldassay銀加強膠體金技術(shù)IFimmunofluorescence免疫熒光體染色技術(shù)RIAradioimmunoassay放射免疫技術(shù)IDTimmunodiffusiontest免疫
4、擴散試驗cELlSAcompetitionenzyme.1inkedimmunosorbentassay競爭ELISAPCFIAparticleconcentrationfluorescenceimmunoassay顆粒濃縮免疫熒光試驗多重PCR檢測CSFV、PPV、PRV的研究摘要豬瘟、豬細小病毒感染、豬偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一類重要的傳染病,每年均給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。為了減少這三種疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨額經(jīng)濟損失,廣大獸醫(yī)工作者在過去的100多年里,建立了許多用于檢測和診師宣三種疾病的方法,但這些方法大多僅限于常規(guī)的免疫學和血清學檢測,只適用于流行病學調(diào)查,而不能夠
5、確定是否正處于感染狀態(tài),并且都存在著敏感性差、特異性不強和,或耗時等缺點,無法滿足臨床上對豬瘟、豬細小病毒感染和豬偽狂犬病的診斷和檢鋇9需要。隨著分子生物學研究的不斷深入和PCR技術(shù)的出現(xiàn),為動物傳染病的診斷和檢測提供了快速、敏感、特異和方便實用的方法。為此,本實驗研究和建立了豬瘟、豬細小病毒感染和豬偽狂犬病的多重PCR診斷和檢測方法,并對多重PCR擴增條件進行了優(yōu)化,對其特異性、敏感性以及臨床應用進行了研究。為進一步在臨床上使用多重PCR方法診斷和檢測這三種豬繁殖障礙性疾病提供參考。,本研究首先在GeaeBank中查出CSFV、PPV、PRv的所有已知序列。對病毒各塞困區(qū)進行同
6、源性分析,確定CSFV的E2基因,PPV的VP2基因和PRV的譬Ⅱ基因作為各病毒擴增的靶序列。利用DNAsis對上述保守區(qū)進行引物設(shè)計.并利用DNAstar對設(shè)計出來的3種病毒引物進行引物二聚體化、同源性和互補性分析,以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體和避免具有較高的同源性和互補性。最后確定了擴增片段為CSFV288bp、PPV575bp、PRV700bp的3種病毒的6條多重PCR引物。在此基礎(chǔ)上,分別進行了各病毒單重PCR的檢測,確定了各單重PCR擴增條件的范圍,建立了這三種病毒單重PCR診斷方法。結(jié)果在退火條件CSFV為50.1.61.1℃40s、PPV為52.8-61.1℃
7、啦s、PRV為56.2-62.2"C40s時的擴增效果為佳,電泳條帶清晰,雜帶較弱,可獲得較滿意的擴增結(jié)果:其他步驟的反應條件以預變性舛℃3min、變性94℃30s、延伸72℃lmin、共30個循環(huán)、再經(jīng)延伸72℃5min后、于4"C10min終止PCR擴增為宜。利用優(yōu)化晤的PCR各擴增條件對各引物濃度、dNTP濃度進行優(yōu)化,結(jié)果引物濃度以CSFV1.o-1.75pmol/ml,PPV1.0-1.75pmol/ml,PRVO.75.1.75pmol/ml為宜;dNTP濃度以CSF