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《豬輪狀病毒地方株的分離鑒定及其VP6基因的克隆與原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、東北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文豬輪狀病毒地方株的分離鑒定及其VP6基因的克隆與原核表達姓名：陳淑紅申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：李一經(jīng)2003.5.1摘要!!!自!!!!!!!自!!=§!!E!!!!!!#!!目$!!!g!!!目!!1511。要豬輪狀病毒(PorcineRotavi,rus，PRv)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之～，給世界各地的畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。我國PRV感染也非常普遍，有些地區(qū)斷奶仔豬陽性率高達72％。本實驗從吉林省某豬場發(fā)生腹瀉的豬群糞樣中，用M
2、Al04細胞培養(yǎng)，分離到一株PRV，盲傳至4代出現(xiàn)明顯病變，經(jīng)電鏡觀察見有典型的車輪狀病毒顆粒。病毒核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)表明：其電泳型為4：2：3：2型，屬于A群輪狀病毒。這株病毒被命名為JL94。／采用雙層法用MAl04細胞進行病毒蝕斑試驗，JL94能形成大多數(shù)直徑約lmm左右的蝕斑，大部分形狀不規(guī)則，少部分呈圓形，鏡下可見清晰的不著色區(qū)，此區(qū)由碎裂的死細胞團構(gòu)成。采集人及9種動物的紅細胞，用病毒的細胞培養(yǎng)物做血凝和血凝抑制試驗，來檢測JL94的血凝特性。血凝試驗證明JL94不凝集雞、鵝、猴、小白鼠
3、、豚鼠、山羊、狗、人的O型、A型及B型紅細胞。對于兔、豬的紅細胞集現(xiàn)象不穩(wěn)定，有待于進～步確定。根據(jù)GenBank中的多株豬A群輪狀病毒VP6蛋白完整基因序列，利用oli9041設計引物，以JL94RNA為模板，通過RT-PCR擴增出長約1．3kb的基因片段，命名為VP6。將其插入克隆載體質(zhì)粒pMDl8-T的EcoKV酶切位點處，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDl8．T—vP6。對克隆的VP6基因進行序列測定，測序結(jié)果顯示JL94VP6基因全長1356bp，含有完整的開放閱讀框架，編碼397個氮基酸。將其VP6序列與豬A群輪狀病毒
4、代表株OSU(噩組I)、Gottfried(亞組II)的VP6進行同源比較，結(jié)果顯示，核苷酸序列同源性分別為8685％、82．41％，氨基酸序列同源性分別為97．48％、93．20％，結(jié)果表明3-L94地方分離株與0SU株在基因型上更為接近。從重組質(zhì)粒pMDl8-T_一VP6上將VP6基因亞克隆到表達載體質(zhì)粒pET．30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導以后表達出預計的45ku的融合蛋白，同時還有一些小的蛋白表達出來，光密度掃描對表達產(chǎn)物進行初步定量表明，45ku融合蛋白占菌體總蛋白的26．5％。表達產(chǎn)
5、物經(jīng)Ni—NTA金屬螯合層析柱純化后，得到純化的His．taggedVP6融合蛋白。采用Western-blot對表達產(chǎn)物及純化產(chǎn)物進行反應原性分析，結(jié)果表明所得His-taggedVP6融合蛋白具有較好的抗原反應特異性。之，pL一本研究為國內(nèi)PRV毒株鑒定、分子流行病學調(diào)查、分子診斷試劑的開發(fā)以及基因工程疫苗的研制提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎。關鍵詞豬輪狀病毒；分離鑒定；VP6基因：克?。涸吮磉_、VIsolationandCharacterizationofPorcineRotavirusandItsVP6GeneC
6、loningandExpressioninEscherichiaColiAbstractPorcineRotavirus(PRV)belongstothefamilyreoviridae．Itisoneofthemajorpathogensofdiarrheainpigletsandcausesamajorhealthworldwideingraziery．InfectionofPRVisalsoprevalentinchina，insomeareatheinfectiousratioofpigletsis72％．A
7、ccuratediagnosisanderiectivevaccinationaremainmeansforthepreventionofPRVdiarrheaInthisstudy，porcinerotaviruswassuccessfullyisolatedfromdiarrhealpigletfecalsamplesfromJilinprovinceMA104cellswereusedforthereplicationandisolationofthevirus．Afterfourpassages，theiso
8、latecouldproduceobviouscytopahiceffects(CPE)．Typicalrotavirusparticleswereseenwithdirectelectronmicroscope．Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)ofitsdsRNAgenomeshoweditsRNA
