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《抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、附件一抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型【背景和目的】谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性遞質(zhì)。在腦缺血、多發(fā)性硬化等多種病理?xiàng)l件下，腦內(nèi)谷氨酸濃度異常增高，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸受體過度激活，Na+和Ca2+大量?jī)?nèi)流，引起細(xì)胞腫脹、鈣穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。通過建立拮抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型，將有利于尋找拮抗谷氨酸受體或通過其他途徑拮抗少突膠質(zhì)細(xì)胞興奮性毒性的有效候選化合物或中藥單體，為減少少突膠質(zhì)細(xì)胞在病理?xiàng)l件下的損傷、增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)提供新的治療藥物?！静牧稀考?xì)胞系：OLN-9
2、3試劑：DMEM，F(xiàn)BS，谷氨酸，PBS，胰蛋白酶，MTT，DMSO，NBQX；儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀【實(shí)驗(yàn)步驟】1.OLN-93細(xì)胞系培養(yǎng)使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，3-4天傳代一次。細(xì)胞多為雙極突起，長(zhǎng)度較短。將細(xì)胞接種于96孔板后更換分化培養(yǎng)基（含0.5%FBS或1%FBS的DMEM），分化4-5天后細(xì)胞突起增加，相互連接形成近似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.模型建立取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、融合度約60-70%的OLN-93，以3.0×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔
3、含200μl分化培養(yǎng)基，分化4-5天后開始實(shí)驗(yàn)。設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組和谷氨酸損傷組，每組3-6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，谷氨酸損傷組加入使用無(wú)血清DMEM新鮮配制的谷氨酸（終濃度為20-40mM），每孔終體積為100μl。培養(yǎng)8小時(shí)或24小時(shí)后，每孔加入10μlMTT（5mg/ml）繼續(xù)孵育3-4h，測(cè)定OD560nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。選取細(xì)胞存活率在20%-60%的谷氨酸濃度作為參考造模濃度。3．模型驗(yàn)證陽(yáng)性藥為非NMDA受體拮抗劑NBQX，使用DMSO配制成30mM母液，在谷氨酸損傷的同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)
4、基中，NBQX終濃度為150μM。對(duì)照組為在谷氨酸損傷的同時(shí)加入等濃度的DMSO。6種候選化合物均以DMSO溶解，配制為10mM的母液，-20℃凍存。加藥前使用PBS梯度稀釋，在谷氨酸損傷的同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，終濃度為1μM和10μM?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】1．谷氨酸損傷細(xì)胞的量效反應(yīng)和時(shí)效反應(yīng)使用20-40mM谷氨酸損傷細(xì)胞，損傷時(shí)間為8小時(shí)或24小時(shí)。結(jié)果表明谷氨酸對(duì)OLN-93的細(xì)胞活力的影響具有一定的時(shí)間和濃度依賴性（圖1）。選擇30mM谷氨酸損傷24h作為模型建立的條件，此時(shí)細(xì)胞存活率降低至40%左右。圖1
5、谷氨酸對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響具有時(shí)間和濃度依賴性。結(jié)果表示為Mean±SD。2．模型驗(yàn)證結(jié)果陽(yáng)性藥NBQX在150μM時(shí)表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，可使細(xì)胞損傷減少20%左右。篩選的6種化合物中只有第三種化合物表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，其他藥物無(wú)保護(hù)作用或作用微弱（圖2）。圖2NBQX可拮抗谷氨酸對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。六種化合物中3和4號(hào)化合物表現(xiàn)出顯著作用，其他化合物作用微弱或無(wú)作用。結(jié)果表示為Mean±SD，數(shù)據(jù)采用ANVOA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與DMSO組相比，**p<0.01，***p<0.001。【結(jié)論】OLN-
6、93分化4-5天后表現(xiàn)出未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞突起明顯增多，谷氨酸可降低OLN-93細(xì)胞活力，并具有一定的時(shí)間和濃度依賴性。確定谷氨酸損傷模型的造模條件為30mM谷氨酸損傷24h，細(xì)胞存活率可降低至40%左右。通過該模型驗(yàn)證了非AMPA受體拮抗劑NBQX可減少谷氨酸對(duì)OLN-93的損傷作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1)VulnerabilityofOligodendrogliatoGlutamate:Pharmacology,Mechanisms,andPrevention.AkiraOka,MichaelJ.B
7、elliveau,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe.TheJournalofNeuroscience,1993,13(4):1441-1453.2)Oligodendrocyteexcitotoxicitydeterminedbylocalglutamateaccumulationandmitochondrialfunction.WenbinDeng,QinYue,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,FrancesE.Jensen.JournalofNeuro
8、chemistry,2006,98:213–222.3)NBQXAttenuatesExcitotoxicInjuryinDevelopingWhiteMatter.PamelaL.Follett,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,andFrancesE.Jensen.TheJournalofNeuroscience,2000,20(24):9235–9241.4)Olig
