抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型

抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型

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1、附件一抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型【背景和目的】谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性遞質(zhì)。在腦缺血、多發(fā)性硬化等多種病理條件下,腦內(nèi)谷氨酸濃度異常增高,導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸受體過度激活,Na+和Ca2+大量內(nèi)流,引起細(xì)胞腫脹、鈣穩(wěn)態(tài)失衡,最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。通過建立拮抗谷氨酸損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的藥物篩選模型,將有利于尋找拮抗谷氨酸受體或通過其他途徑拮抗少突膠質(zhì)細(xì)胞興奮性毒性的有效候選化合物或中藥單體,為減少少突膠質(zhì)細(xì)胞在病理條件下的損傷、增強少突膠質(zhì)細(xì)胞保護提供新的治療藥物?!静牧稀考?xì)胞系:OLN-9

2、3試劑:DMEM,F(xiàn)BS,谷氨酸,PBS,胰蛋白酶,MTT,DMSO,NBQX;儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱,離心機,倒置顯微鏡,酶標(biāo)儀【實驗步驟】1.OLN-93細(xì)胞系培養(yǎng)使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞,3-4天傳代一次。細(xì)胞多為雙極突起,長度較短。將細(xì)胞接種于96孔板后更換分化培養(yǎng)基(含0.5%FBS或1%FBS的DMEM),分化4-5天后細(xì)胞突起增加,相互連接形成近似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可進行后續(xù)實驗。2.模型建立取生長狀態(tài)良好、融合度約60-70%的OLN-93,以3.0×104/ml的密度接種于96孔板中,每孔

3、含200μl分化培養(yǎng)基,分化4-5天后開始實驗。設(shè)置調(diào)零組、對照組和谷氨酸損傷組,每組3-6個復(fù)孔。對照組加入無血清培養(yǎng)基,谷氨酸損傷組加入使用無血清DMEM新鮮配制的谷氨酸(終濃度為20-40mM),每孔終體積為100μl。培養(yǎng)8小時或24小時后,每孔加入10μlMTT(5mg/ml)繼續(xù)孵育3-4h,測定OD560nm,計算細(xì)胞存活率。選取細(xì)胞存活率在20%-60%的谷氨酸濃度作為參考造模濃度。3.模型驗證陽性藥為非NMDA受體拮抗劑NBQX,使用DMSO配制成30mM母液,在谷氨酸損傷的同時加入細(xì)胞培養(yǎng)

4、基中,NBQX終濃度為150μM。對照組為在谷氨酸損傷的同時加入等濃度的DMSO。6種候選化合物均以DMSO溶解,配制為10mM的母液,-20℃凍存。加藥前使用PBS梯度稀釋,在谷氨酸損傷的同時加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,終濃度為1μM和10μM?!緦嶒灲Y(jié)果】1.谷氨酸損傷細(xì)胞的量效反應(yīng)和時效反應(yīng)使用20-40mM谷氨酸損傷細(xì)胞,損傷時間為8小時或24小時。結(jié)果表明谷氨酸對OLN-93的細(xì)胞活力的影響具有一定的時間和濃度依賴性(圖1)。選擇30mM谷氨酸損傷24h作為模型建立的條件,此時細(xì)胞存活率降低至40%左右。圖1

5、谷氨酸對少突膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響具有時間和濃度依賴性。結(jié)果表示為Mean±SD。2.模型驗證結(jié)果陽性藥NBQX在150μM時表現(xiàn)出一定的保護作用,可使細(xì)胞損傷減少20%左右。篩選的6種化合物中只有第三種化合物表現(xiàn)出顯著的保護作用,其他藥物無保護作用或作用微弱(圖2)。圖2NBQX可拮抗谷氨酸對少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。六種化合物中3和4號化合物表現(xiàn)出顯著作用,其他化合物作用微弱或無作用。結(jié)果表示為Mean±SD,數(shù)據(jù)采用ANVOA進行統(tǒng)計分析,與DMSO組相比,**p<0.01,***p<0.001?!窘Y(jié)論】OLN-

6、93分化4-5天后表現(xiàn)出未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),細(xì)胞突起明顯增多,谷氨酸可降低OLN-93細(xì)胞活力,并具有一定的時間和濃度依賴性。確定谷氨酸損傷模型的造模條件為30mM谷氨酸損傷24h,細(xì)胞存活率可降低至40%左右。通過該模型驗證了非AMPA受體拮抗劑NBQX可減少谷氨酸對OLN-93的損傷作用?!緟⒖嘉墨I】1)VulnerabilityofOligodendrogliatoGlutamate:Pharmacology,Mechanisms,andPrevention.AkiraOka,MichaelJ.B

7、elliveau,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe.TheJournalofNeuroscience,1993,13(4):1441-1453.2)Oligodendrocyteexcitotoxicitydeterminedbylocalglutamateaccumulationandmitochondrialfunction.WenbinDeng,QinYue,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,FrancesE.Jensen.JournalofNeuro

8、chemistry,2006,98:213–222.3)NBQXAttenuatesExcitotoxicInjuryinDevelopingWhiteMatter.PamelaL.Follett,PaulA.Rosenberg,JosephJ.Volpe,andFrancesE.Jensen.TheJournalofNeuroscience,2000,20(24):9235–9241.4)Olig

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