基因結構與功能分析1

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1、生物化學與分子生物學第二十二章基因結構與功能分析技術TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction人類的多種疾病都與基因的結構或功能異常有關，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結構與功能。DNA序列測定基因轉錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達產物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機突變篩選策略第一節(jié)基因結構分析技術一、基因一級結構解析技術基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結構最精確的

2、技術就是DNA測序（DNAsequencing）。（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法Sanger雙脫氧測序（dideoxysequencing）法Maxam-Gilbert化學降解測序法（二）全自動激光熒光DNA測序技術的原理基于Sanger雙脫氧法1.四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結果均相當于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產物可在同一個泳道內電泳。2.單色熒光法：采用單一熒光染料標記引物5′-端或dNTP，所有產

3、物的5′-末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產物也必須在四個不同的泳道內電泳（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術焦磷酸測序技術操作簡單，結果準確可靠，可應用于單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）分析、等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關基因序列中的突變點等領域。該方法的測序長度一般短于Sanger法。（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術循環(huán)芯片測序（cyclic-arraysequencing）①可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需

4、電泳，設備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本優(yōu)勢：技術平臺：454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等?；玖鞒蹋孩賹⒒蚪MDNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。（五）單分子測序技

5、術被稱為第三代測序技術主要策略：①通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技術（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學方式來實現(xiàn)單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。二、基因轉錄起點分析技術轉錄起點（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定TSS以mRNA為模板，經(jīng)逆轉錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上p

6、olyC尾，并以此引導合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的5?-末端進行測序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。但可導致5?-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。（二）用5?-cDNA末端快速擴增技術鑒定TSS常用的技術包括5?-末端基因表達系列分析（5?-endserialanalysisofgeneexpression，5?-SAGE）和帽分析基因表達（capanalysisgeneexpression，CAGE）技術。（

7、三）用數(shù)據(jù)庫搜索TSS利用對寡核苷酸帽法構建的全長cDNA文庫5?-末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個TSS數(shù)據(jù)庫（databaseoftranscriptionstartsites，DBTSS），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術相結合開發(fā)了一種TSS測序法，從而實現(xiàn)了一次測試可產生1×107個TSS的數(shù)據(jù)。三、基因啟動子結構分析技術（一）用PCR結合測序技術分析啟動子結構該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動子序列，設計一對引物，然后以PCR法擴增啟動子，經(jīng)測序分析啟動子序列結構。（二）用

8、核酸-蛋白質相互作用技術分析啟動子結構1.用足跡法分析啟動子中潛在的調節(jié)蛋白結合位點足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質結合的DNA區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結構的方法。分類：酶足跡法化學足跡法（1）用核酸酶進行足跡分析酶足跡法（enzymaticfootprinting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質復合物，然后通過電泳