人乳頭瘤病毒基因檢測及分型方法研究進(jìn)展

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1、人乳頭瘤病毒基因檢測及分型方法研究進(jìn)展【摘要】流行病學(xué)和分子生物學(xué)資料表明，人乳頭瘤病毒(HPV)的感染能夠引起子宮內(nèi)上皮樣瘤變(CIN)及宮頸癌的發(fā)生。并且HPV的不同型別致病力也存在差異,高危型別、高病毒載量的持續(xù)感染是促使宮頸癌發(fā)生的重要因素。因此，HPV感染的早期發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確分型及病毒定量對宮頸癌的防治具有重要意義。作者對HPV基因的檢測和分型方法如核酸雜交、PCR、熒光定量PCR等，以及各方法的優(yōu)缺點進(jìn)行綜述。【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒;聚合酶連反應(yīng);實時熒光定量;分子信標(biāo);文獻(xiàn)綜述　人乳頭瘤病毒(humanpapillomavius，HPV)是促使子宮內(nèi)上皮樣瘤

2、變(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)及宮頸癌發(fā)生的已知的重要因素[1-2]。德國學(xué)者Haraldzur16Hausen因發(fā)現(xiàn)了HPV與宮頸癌之間的關(guān)系獲得了2008年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。HPV具有多種型別，分為高危型和低危型，不同的型別致癌潛能存在差別。高危型、高病毒載量的持續(xù)感染可以引起宮頸癌的發(fā)生[3]。2009年5月召開的第25屆國際乳頭瘤病毒會議，說明了全球HPV的感染率呈上升趨勢，并且出現(xiàn)了新的基因型別[4]。在我國，宮頸癌的發(fā)病率也呈上升趨勢并且趨于年輕化，因此，HPV感染的檢測、病毒定量、基因分型對臨床宮頸癌的防

3、治具有重要意義。在相關(guān)資料的基礎(chǔ)上，我們對HPV基因的檢測和分型方法如核酸雜交、PCR、熒光定量PCR等，以及各方法的優(yōu)缺點進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述，以期進(jìn)一步建立可靠、簡便、快速的HPV檢測、定量、分型方法。　　1HPV的結(jié)構(gòu)　　HPV為雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組約8000bp，分為早期編碼區(qū)(earlyregion)、晚期編碼區(qū)(lateregion)、非編碼區(qū)(noncodingregion)，含8個可譯框(openreadingframe，ORF)，其中早期ORF6個、晚期ORF2個。它屬于無包膜病毒，由DNA核心和衣殼組成，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1?！　D1HPV基因組結(jié)

4、構(gòu)示意圖　　Fig1SchematicofHPVgenome　　2HPV的分型　　HPV根據(jù)生物學(xué)特征、致癌潛能可分為高危型(highrisk)和低危型(low16risk)。HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68屬于高危型，HPV6、11、42、43、44屬于低危型[5]。高危型整合于細(xì)胞基因組中，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān);低危型不整合于細(xì)胞基因組中，主要引起疣的發(fā)生。　　3HPV的檢測及分型方法　　HPV不能體外培養(yǎng)，其檢測主要是基于HPVDNA的分子生物學(xué)方法?！　?.1HPVDNA的核酸雜交檢測　　核酸雜交檢

5、測主要包括核酸印跡(Southernblot)、原位雜交(insituhybridization，ISH)、雜交捕獲(HybridCapture,HCⅡ)。早期，HPV的檢測主要是應(yīng)用核酸印跡、ISH。核酸印跡是HPV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，適用于其基因分型和HPVDNA分子質(zhì)量分析，但靈敏度較低、操作復(fù)雜，需用新鮮的組織標(biāo)本，用福爾馬林等固定劑固定的組織中，DNA可發(fā)生交聯(lián)或降解，從而影響雜交結(jié)果;ISH雖可進(jìn)行定位，但特異性低。因此大大限制了它們在臨床的應(yīng)用。　　HCⅡ是Digene公司建立起來的一種非放射性的分子雜交化學(xué)發(fā)光信號放大系統(tǒng)。樣品HPVDNA雙鏈被

6、釋放并分解為可雜交的核苷酸后，單鏈標(biāo)記的固相化的RNA探針與目標(biāo)HPVDNA雜交，DNARNA的雜交信號在固相載體上轉(zhuǎn)化為免疫結(jié)合，由標(biāo)記堿性磷酸酶的抗體介導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。HCⅡ16是目前唯一被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床HPV篩查的方法[6]。HCⅡ能夠區(qū)分HPV的高危型和低危型，但不能確定其具體型別。有時探針之間存在交叉反應(yīng)[7]，并且敏感度低于PCR方法。盡管如此，它無需基因擴增，降低了實驗污染的可能性;較之PCR方法，其假陽性、假陰性率均較低。作為一種篩查方法，HCⅡ法在臨床仍得到了廣泛應(yīng)用[6]?！　?.2HPVDNA的PCR檢測

7、　　PCR是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增十萬乃至百萬倍,擴增出的足量DNA產(chǎn)物供分析研究和檢測鑒定，從而提高了HPV感染的檢出率?；赑CR衍生出了多種用于HPV檢測和分型的方法?！　?.2.1型特異引物PCR　　型特異性PCR(typespecificPCR)是利用型特異引物，對組織標(biāo)本提取的HPVDNA進(jìn)行特異性的擴增，而后凝膠電泳進(jìn)行檢測和分析，從而判斷感染與否及感染的型別。但是，單管只能檢測1種