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《基因克隆技術(shù)的發(fā)展》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、基因克隆技術(shù)的發(fā)展摘要基因克隆技術(shù)是生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域里非常重要的部分，為了縱覽基因克隆的理論和技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新歷程，對各種技術(shù)體系，正向遺傳學(xué)途徑、反向遺傳學(xué)途徑進行了綜述。隨著后基因組時代的到來，基因克隆技術(shù)將發(fā)揮更加重要的作用。關(guān)鍵詞功能性克隆同源序列技術(shù)表達克隆技術(shù)轉(zhuǎn)座子標簽基因芯片電子克隆幾種模式生物基因組測序和人類基因組計劃的相繼完成，使人們對基因的研究很快進入后基因組時代。基因組學(xué)時代的主要任務(wù)是圖譜制作性和序列測定，后基因組學(xué)時代則是進行基因組功能注釋，這也是功能基因組學(xué)的主要研究目標[1-2]。如何利用基因這一重要的資源，關(guān)于基因?qū)＠?/p>
2、權(quán)的建立和完善的基因爭奪大戰(zhàn)的硝煙也正在彌漫全球?？寺』虿粌H可以用來興旺生命科學(xué)工業(yè)(制藥業(yè)等)，改良農(nóng)作物、畜禽品種等，還可以對遺傳性疾病進行基因治療，探索疾病的分子機制和生物發(fā)育調(diào)控規(guī)律。克隆基因的途徑有兩種，正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑。前者是依據(jù)目標基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)，通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進行的；后者則著眼于基因本身，通過特定的序列或在基因組中的位置進行?；虻目寺∫话悴捎孟铝屑夹g(shù)：同源序列技術(shù)、差異表達基因分離技術(shù)、表達序列標簽技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)、基因芯片技術(shù)和電子克隆技術(shù)等。1.功能性克隆通過基因產(chǎn)物的克隆技術(shù)在傳統(tǒng)遺
3、傳學(xué)占主導(dǎo)地位的時代，人們以基因產(chǎn)物為導(dǎo)向來分離克隆基因。由于基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能已知，可通過分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，設(shè)計探針或引物從基因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選克隆，也可以制備產(chǎn)物抗體，從表達載體構(gòu)建的cDNA文庫中篩選相應(yīng)克隆，進而分離目的基因。若研究者可得到足夠多的純化目的蛋白以用于制備特異性抗體時，可以采用經(jīng)典的免疫篩選表達文庫的方法，篩選陽性克隆獲取其目的基因[3]。除了免疫篩選方法外，也可根據(jù)目的蛋白的生物學(xué)功能，利用同位素標記的配體來篩選受體表達的陽性克隆。當所分離的目的蛋白較難大量獲得，但純度較高時，
4、可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，據(jù)此合成寡核苷酸用于cDNA文庫的篩選；或根據(jù)所獲得的基因序列，指導(dǎo)5’端的引物合成，根據(jù)mRNA3’端poly—A序列指導(dǎo)合成poly—T的3’端引物，用PCR技術(shù)從制備細胞的mRNA或直接從胞漿內(nèi)溶物中合成相應(yīng)的cDNA，將該cDNA克隆到表達載體上進行產(chǎn)物表達。1.同源性序列克隆技術(shù)隨著基因研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的基因與其他的基因都有一定的聯(lián)系：生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列?；诖嗽?，在其他種屬同源基因被克隆的前提下，構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后用已知分
5、子高保守序列設(shè)計簡并引物，并用簡并引物對含有目的基因的DNA文庫進行PCR擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物進行擴增、克隆和功能鑒定。對于同源性很高的基因，可以直接用作探針進行非嚴謹性雜交篩選另一物種的DNA文庫。同源性序列克隆技術(shù)自提出以來，受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視，發(fā)展很迅速，但有些問題是值得重視和思考的：①由于密碼子的簡并性和不同同源序列間同源程度的差異，簡并引物的特異性要設(shè)計得當，必要時需要設(shè)計幾套引物組合。②由于某些同源序列并不專屬于某一基因家族，因而擴增產(chǎn)物不一定是某一基因家族成員。③基因家族成員往往成簇存在，克隆的基因片段是否為目的基因尚需進
6、一步判斷。因此對PCR擴增產(chǎn)物和克隆產(chǎn)物，有必要進行基因與性狀共分離分析，插入失活或遺傳轉(zhuǎn)化等功能鑒定工作，以便最終篩選到目的基因。2.表型克隆技術(shù)細胞在增殖、分化、外界環(huán)境變化等某些異常狀態(tài)下(如癌變、異常增生)，常有某些新基因特異性表達或表達異常地增高，而另一些基因可能表達降低或缺失，因而分離差異表達基因?qū)⑹钦J識生物體的生長發(fā)育等生命活動過程的入手點，以此為基礎(chǔ)，才能深入理解基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達與調(diào)控。差異表達基因的分離方法也伴隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展由單一化發(fā)展為多元化，而且呈各種方法互相結(jié)合的趨勢。分離差異表達基因的3種基本方法為：差式篩選
7、[4]、扣除雜交[5-7]、差異展示反轉(zhuǎn)錄[8]。差式篩選法是分別從有特異表達基因的目標樣和無特異表達基因的參照樣中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并構(gòu)建Ts的cDNA文庫，分別將從TS和RS中提取mRNA制成cDNA探針，分別用TS和RS的eDNA探針與TScDNA文庫的菌落或噬菌斑作原位雜交，選出只與Ts雜交，而不與RS雜交的克隆即為TS特異表達的克隆。此法常要經(jīng)過多輪菌斑雜交，不僅費力費錢，重復(fù)性差，而且靈敏度很低?？鄢s交則是用TS提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA探針與Rs的過量mRNA或cDNA雜交，經(jīng)兩輪充分雜交后，移去雜交分子和過量的R
8、S的mRNA或cDNA，將不形成雜交體的TS的eDNA純化富集，擴增，建立相應(yīng)cDNA文庫即為差異表達基因cDNA文庫。但
