《基因克隆的載體》PPT課件

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1、基因工程張銳第二節(jié)基因克隆的載體載體的概念及特點(diǎn)質(zhì)粒載體（plasimidvectors）噬菌體載體（phagevectors）柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）引言載體（vector）：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)；具有1-2個(gè)選擇標(biāo)記基因，如對抗生素的抗性基因等；具備多克隆位點(diǎn)（MultipleCloneSites，MCS），而且可攜帶外源DNA片段的長度范圍較寬;自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作

2、和DNA的制備。具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。載體的分類根據(jù)載體工作方式的不同可分為質(zhì)粒載體（plasimidvectors）、噬菌體載體（phagevectors）、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體（考斯質(zhì)粒）質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立于染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的遺傳物質(zhì)。大多數(shù)質(zhì)粒是閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。一質(zhì)粒載體（plasimidvectors）質(zhì)粒的特點(diǎn)（1）自主復(fù)制性。質(zhì)粒含有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)（Origin,簡稱ori）

3、，有些質(zhì)粒具有獨(dú)立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)（Replicon），因此，質(zhì)粒DNA可以自主復(fù)制，形成少則幾個(gè)多則成百上千個(gè)拷貝。（2）可擴(kuò)增性。在格蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)粒的復(fù)制一般有兩種復(fù)制形式，即嚴(yán)緊型（Stringent）和松弛型（Relaxed）。質(zhì)粒的復(fù)制類型：一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。根據(jù)拷貝數(shù)的多少將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stringentplasmid）,拷貝數(shù)為1-5；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為6-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主

4、細(xì)胞間也可能有很大的變化。嚴(yán)緊型質(zhì)粒（Stringent）：這類質(zhì)粒的復(fù)制由細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶Ⅲ介導(dǎo)，并被質(zhì)粒上編碼的蛋白因子正調(diào)控，由于這些蛋白因子極不穩(wěn)定使得每個(gè)細(xì)胞只能復(fù)制少數(shù)幾個(gè)質(zhì)粒拷貝，一般把一個(gè)細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少于5個(gè)的質(zhì)粒稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒（Relaxed）：這類質(zhì)粒的復(fù)制需要半衰期較長的DNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶及其他復(fù)制輔助蛋白因子，這類質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中一般可達(dá)到30~50個(gè)拷貝，所以稱為松弛型質(zhì)粒。質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增：當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)入生長后期，加入氯霉素可以抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成，阻斷

5、宿主菌的大部分代謝途徑，松弛型質(zhì)粒就能利用豐富的原料及能量進(jìn)行復(fù)制，最終每個(gè)細(xì)胞就能累積上千個(gè)DNA分子，把這種操作稱為質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增。（3）可轉(zhuǎn)移性。在移動(dòng)基因mob、轉(zhuǎn)移基因tra、順式作用元件bom等因子的作用下，許多野生型質(zhì)?？梢酝ㄟ^細(xì)胞的接合（conjugation）作用從一個(gè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主細(xì)胞中。（4）不相容性。具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同的質(zhì)粒不能穩(wěn)定的存在于同一個(gè)受體細(xì)胞的現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）。細(xì)胞分裂理想質(zhì)粒的改造與構(gòu)建（1）刪除不必要

6、的DNA區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的相對分子量，以提高外源DNA的裝載量；一般大于20Kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率很低而且不穩(wěn)定。（2）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。如滅活編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的mob基因以提高質(zhì)粒的安全性，滅活對質(zhì)粒的復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控的基因，以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（3）加入易于識別的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以篩選得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨芐青霉素抗性基因)、Kanr(卡那霉素抗性基因)、Tetr(四環(huán)素抗性基因)

7、、Cmr或cat(氯霉素抗性基因)、Neor(新霉素抗性基因)；LacZ△M15缺失第11-41位的氨基酸LacZ’N端140個(gè)氨基酸LacZ′MCS140個(gè)氨基酸+MCSLacZ1024個(gè)氨基酸LacZ△M15F質(zhì)粒載體LacZE.coliLacZ△M15+LacZ′X-galLacZ△M15+LacZ′ΩDNAX-gal篩選標(biāo)記基因：α-互補(bǔ)大腸桿菌?-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的?-片段和?-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將缺失了第11-41位氨基酸的編碼

8、?片段的LacZ△M15構(gòu)建在F質(zhì)粒上先轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，而將編碼該酶N端140個(gè)氨基酸的?-片段的LacZ′基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中。當(dāng)含有LacZ′基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的?-片段就能和寄主編碼的?片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是?-互補(bǔ)（alpha-complementation）.將這