用于基因克隆的載體

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1、第三章用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征3.1載體的功能及特征3.1.1載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件3.1.2載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.2質(zhì)粒載體3.2.1質(zhì)粒的基本特征A:質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被

2、穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子；B:質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中；C:絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的；D:絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA；E:質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb。雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）3.2.2質(zhì)粒的分子形式3.2.2.1共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)CovalentclosecircularDNA呈超螺旋（SC）（supercoil）3.2.2.3線形DNA（linear，L-DNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。3.2.2.2開環(huán)DNA（opencircular

3、，ocDNA）同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL3.2.2.4質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率3.2.3質(zhì)粒的自主復制性質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質(zhì)粒DNA上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關(guān)系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不

4、相容性群以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容3.2.4質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性：分子機制兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，復制時受各自拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，經(jīng)過若干復制和細胞分裂周期后仍能共處同一細胞內(nèi)。3.2.5質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性

5、菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞，如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定。大腸桿菌接合（conjunction）3.2.6攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有

6、重要意義3.2.7質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標記基因Apr3.2.7.1天然質(zhì)粒的缺陷（1）分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標記不理想ColE1質(zhì)

7、粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）?？梢酝ㄟ^插入失活篩選。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細胞colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。3.2.7.2理想載體條件A、較小的分子和較高的拷貝數(shù)B、多個單一的限制性內(nèi)切酶位點C、兩種以上的選擇標記D、易導入宿主細胞并復制和表達3.2.7.2質(zhì)粒的選擇標記及其工作原理：氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性

8、標記：i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生