植物基因克隆的載體.ppt

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1、第三章基因克隆載體Vectors載體(vector)：在基因工程中，攜帶目的基因或DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。一、載體的概念作為載體使用的必須是能進(jìn)入植物寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的核酸分子。二、載體的功能1、運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；2、為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；3、為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。三、發(fā)展概況1.第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二階段：增大載體容量（降低長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因

2、。如pUC系列載體。3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿(mǎn)足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。按載體性質(zhì)分四、分類(lèi)質(zhì)粒載體、噬菌體載體和人工染色體目前發(fā)展起來(lái)的植物基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)分為兩大類(lèi)：一是病毒載體系統(tǒng)二是質(zhì)粒載體系統(tǒng)※（1）有復(fù)制起點(diǎn)※（2）具有若干個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)※（3）具備合適的篩選標(biāo)記※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對(duì)較?。?）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件五、基因工程載體必須具備的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)獨(dú)立于細(xì)菌染

3、色體外的能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，偶見(jiàn)于鏈霉菌和酵母比病毒還簡(jiǎn)單的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦離開(kāi)寄主細(xì)胞則無(wú)法繁殖。大腸桿菌的質(zhì)粒二、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名1946年，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌質(zhì)粒是大腸桿菌的F因子，它的發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌遺傳學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。1957年，日本學(xué)者報(bào)道了志賀菌(Shigella)中質(zhì)粒介導(dǎo)抗生素抗性的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。（一）質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)在以后的20多年中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各種細(xì)菌攜帶質(zhì)粒，且它們的表型特征已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了致育性和藥物抗性的范圍。70年代末，隨著遺傳工程的崛起，質(zhì)粒作為載體己被廣泛應(yīng)用在遺傳工程和分子生物學(xué)的研究中。對(duì)很多不同微生物中的質(zhì)粒進(jìn)行了基因克

4、隆和生物學(xué)功能分析，使質(zhì)粒的生物學(xué)跨入了空前繁榮的研究時(shí)期。二、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名（一）質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)（二）質(zhì)粒的命名原則質(zhì)粒可以依據(jù)其表型效應(yīng)、大小、復(fù)制特性、轉(zhuǎn)移性或親和性差異劃分為不同的類(lèi)型。最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertilityfactor，致育因子)、R質(zhì)粒(resistancefactor，抗性質(zhì)粒)和Col質(zhì)粒(colicin，大腸桿菌毒素質(zhì)粒)等。隨著研究工作的深入和發(fā)展，愈來(lái)愈多的含有質(zhì)粒的微生物新類(lèi)群和新質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏統(tǒng)一的命名規(guī)則而導(dǎo)致文獻(xiàn)中質(zhì)粒名稱(chēng)的混亂。其規(guī)則是：質(zhì)粒的名稱(chēng)一般由三個(gè)英文字母及編號(hào)組成，

5、第一個(gè)字母一律用小寫(xiě)p表示，后兩個(gè)字母應(yīng)大寫(xiě)，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)、表型性狀或其他特征的英文縮寫(xiě)。編號(hào)為阿拉伯?dāng)?shù)字，用于區(qū)分屬于同一類(lèi)型的不同質(zhì)粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。直至1976年Novick等才提出一個(gè)可為質(zhì)粒研究者普遍接受和遵循的命名原則。（二）質(zhì)粒的命名原則命名舉例pBR322是最早構(gòu)建的質(zhì)粒之一“p”表明它是一個(gè)質(zhì)?！癇R”表示最初構(gòu)建它的兩個(gè)人的名字首字母：Bolivar和Rodriguez“322”區(qū)別于該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒，如pBR325、pBR327等三、質(zhì)粒的基本特性（1）質(zhì)粒分子較小一般為1-200Kb，最大的可達(dá)14

6、00kb(如苜蓿根瘤菌質(zhì)粒pRm141a)。（2）編碼特性——表型多樣化如抗生素的抗性、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物、產(chǎn)生毒素（如大腸桿菌素、腸毒素）、合成限制性?xún)?nèi)切酶或修飾酶、生物固氮和殺蟲(chóng)等。3、質(zhì)粒的存在形式體外理化因子作用下可形成下列形式開(kāi)環(huán)DNA分子(oc-DNA)線(xiàn)性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)生理?xiàng)l件下：以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(Covalentclosecircular,ccc-DNA)形式存在三、質(zhì)粒的基本特性在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快

7、、lDNA次之、ocDNA最慢。（4）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率三、質(zhì)粒的基本特性（5）自主復(fù)制性攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制（6）不相容性同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒在同一細(xì)菌中不能相容，不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一細(xì)菌中可共存（7）可擴(kuò)增性質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類(lèi)松弛型復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制（8）可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，大多質(zhì)粒可通過(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)。非結(jié)合細(xì)菌可通過(guò)人工方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化（1）質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居