《基因克隆的載體》ppt課件

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1、基因克隆的載體載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：1、分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。2、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。3、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。5、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。6、從安全角度考慮，要求載

2、體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。載體功能克隆載體:克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:把一個(gè)基因插入到染色體組中載體來源：質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞克隆載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVB

3、AC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載

4、體的種類和特征第一節(jié)質(zhì)粒（plasmid）載體質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲(chǔ)存。主要是DNA水平上的操作。基因表達(dá)的質(zhì)粒載體允許外源D

5、NA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。一、質(zhì)粒的生物學(xué)特性：1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA）L型線性DNA（cDNA）2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：106~108D3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn)LOCSC4、質(zhì)粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀?？剐蕴卣?、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等5、質(zhì)粒DNA的類型：接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質(zhì)粒和含抗菌素抗性基因的R質(zhì)粒；F因子和F`因子等。按接合轉(zhuǎn)移

6、功能分類主要基因按抗性記號(hào)分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，長生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒6、質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：低拷貝的質(zhì)粒（1～3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（接合型）高拷貝的質(zhì)粒（10~60）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型）7、質(zhì)粒的不親合性在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種

7、不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。（二）、質(zhì)粒DNA的分離與純化1、氯化銫密度梯度離心法；2、堿變性法；3、微量堿變性法。1.氯化銫密度梯度離心法1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形

8、成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會(huì)嵌入到DNA鏈的堿基中去。