農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實驗指導(dǎo)

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1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、實驗?zāi)康?了解低溫離心機、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺等儀器的使用。2學習真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理；掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的實驗方法，了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作流程。二、實驗原理農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤屮的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠瘻瘤。農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移

2、與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。實驗一培養(yǎng)基配制一、儀器和試劑1、儀器：高壓滅菌鍋，超凈工作臺2、藥品：Beefextract（牛肉浸膏）5g/L,Yeastextract（酵母提取物）lg/L,Peptone（蛋白腺）5g/L,Sucrose（蔗糖）5g/L,MgSO4.7H2O0.4g/100ml,Agar（瓊脂）1.5g/100ml,MS粉，有機溶液，肌醇，F(xiàn)e鹽，NAA（荼乙酸），6-BA（6■節(jié)氨基腺卩票吟）,卡那霉素（kan）,利福平（rif）,鏈霉素（str）。二、實驗方法第一組配制YEB固體培

3、養(yǎng)基1、配制250mlYEB固體培養(yǎng)基：先稱取1.25gBeefextract（牛肉浸膏）；1.25gPeptone（蛋白豚）；0.25gYeastextract（酵母提取物）；1.25gSucrose（蔗糖）；lgMgSO4.7H2O；瓊脂粉3.75g；將上述藥品置于250ml三角瓶中，用量筒稱取200ml蒸憾水將其溶解混勻，然后再定容至250ml,用NaOH調(diào)pH二7.4。2、滅菌：將盛有250ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60°C

4、時（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100

5、jg/mlkan+50pg/mlStr+50pg/mlrif）,以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效。4、倒板：將抗生素與培養(yǎng)基混勻，每個平皿倒15ml培養(yǎng)基，可以倒16個平皿，倒完后打開平皿蓋，在紫外燈下照lOmin,等待培養(yǎng)基凝固，蓋上平皿蓋,封口備用。第二組配制YEB液體培養(yǎng)基1、配制500mlYEB液體培養(yǎng)基：先稱取2.5gBeefextract（41肉浸膏）；2.5gPeptone（蛋白月東）；0.5gYeastextract（酵母提取物）；2.5gSucrose（蔗糖）；2gMgSO

6、4.7H2O；將上述藥品置于500ml三角瓶中，用量筒稱取450ml蒸館水將其溶解混勻，然后再定容至500ml,用NaOH調(diào)pH=7.4。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60°C吋（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100pg/mlkan+50pg/mlStr+50pg/mlrif）,以免溫度過高導(dǎo)致抗牛素失效。4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到試管和三角瓶中，每個試管中分裝5ml,分裝12個試管。每個三角瓶中倒入35ml

7、,共12個三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第三組配制MS液體培養(yǎng)基1、配制500mlMS液體培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸館水，稱取2.15gMS粉置于蒸憎水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5mllOO倍肌醇濃縮液；5ml有機溶液的混合液，然后混勻定容至500ml,用NaOH調(diào)pH=5.8o2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱,用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、乙酰丁香酮的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60°C時（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的乙酰丁香酮。4、

8、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到三角瓶中，每個三角瓶中倒入40ml,共12個三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第四組配制MS共培養(yǎng)基1、配制SOOmlMS固體共培養(yǎng)基:先在500ml三角瓶中加入400ml蒸館水,稱取2.15gMS粉置于蒸館水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5mll00倍肌醇濃縮液；5ml有機溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照實際需要，根據(jù)母液濃度計算用量），混勻定容至500ml,用NaOH調(diào)pH=5.8,然后再加入7%的瓊脂粉3.5go2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角

9、瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱,用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個平皿中倒入25ml,共20個平皿。4、分裝好后，封口備用。第五組配制MS分化篩選培養(yǎng)基1、配制lOOOmlMS固體共培養(yǎng)基：用2個500ml三角瓶進行盛取，先在50