農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù).ppt

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1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)講課人：楊晶分子生物學(xué)操作技術(shù)之實(shí)驗(yàn)五一、轉(zhuǎn)基因植物概述轉(zhuǎn)基因辣椒轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)基因玫瑰日閉幕的東京國(guó)際花卉博覽會(huì)上，全球首批真正的藍(lán)玫瑰首次在公眾面前亮相。1、學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理；2、掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的實(shí)驗(yàn)方法，了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作流程。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康母┺r(nóng)桿菌，屬根瘤菌科，為革蘭氏陰性。根癌農(nóng)桿菌感染雙子葉植物時(shí)，可在被感染的傷口形成冠癭瘤,誘導(dǎo)有關(guān)的質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒上有一段T-DNA區(qū)，人們將外源基因插入到T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染使攜帶外

2、源基因的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)入植物基因組中，從而實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合。三、實(shí)驗(yàn)原理T-DNA1、儀器：超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，恒溫?fù)u床，組織培養(yǎng)室；2、試劑：農(nóng)桿菌EHA105，YEB培養(yǎng)基，MS液體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)基（MS+6-BA+NAA），分化培養(yǎng)基（MS+6-BA）生根培養(yǎng)基（MS+IBA+NAA）；3、材料：紅花無菌苗。四、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑phaT35SRBNOS(A)BarTargetgeneNcoIkpnIHindIIIspeILBphaPPstIXmnI改造后的農(nóng)桿菌的T-DNA區(qū)，含有目的地基因

3、和Bar篩選基因五、實(shí)驗(yàn)方法（一）農(nóng)桿菌菌液的制備用牙簽蘸取農(nóng)桿菌，在YEB培養(yǎng)基上劃線，達(dá)到純化農(nóng)桿菌的目的。（二）制備工程菌（搖菌）用牙簽挑取劃線得到的單菌落，將其置于YEB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，28℃,180rpm，制備用于侵染轉(zhuǎn)化的工程菌。將農(nóng)桿菌離心，2000rpm，10min，收集菌體,目的是去除細(xì)菌培養(yǎng)基的高濃度鹽。（三）離心，收集菌體（四）重懸菌體用液體MS培養(yǎng)基將菌體用移液槍吹打起來，使菌體重新懸浮，其目的是減少細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)植物體的傷害。將預(yù)培養(yǎng)的紅花子葉放入菌液中浸染8-25min，

4、在侵染過程中輕輕搖晃，確保菌液充分進(jìn)入到紅花子葉中。（五）侵染轉(zhuǎn)化取出外植體，將其放在無菌濾紙上，充分吸干菌液，避免菌液殘留在紅花子葉上，使其在培養(yǎng)過程中，菌液過量生長(zhǎng)。（六）除菌首先將紅花子葉置于共培養(yǎng)上，使其生長(zhǎng)。培養(yǎng)一周后，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，待其誘導(dǎo)分化出不定芽后，繼續(xù)培養(yǎng)，不定芽分化成苗后，將其移入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。（七）侵染后的培養(yǎng)六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果農(nóng)桿菌侵染時(shí)間8min10min12min15min20min25min外植體數(shù)量101010101010染菌情況分化情況轉(zhuǎn)化率七、

5、注意事項(xiàng)1、在操作過程中，一定要保證無菌，整個(gè)操作過程均需要再無菌的條件下完成。2、進(jìn)入超凈工作臺(tái)前，要檢查紫外燈是否關(guān)閉，避免對(duì)皮膚造成損害。3、進(jìn)入超凈工做臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，要進(jìn)行表面消毒，用酒精噴灑并擦凈臺(tái)面和雙手。八、思考題1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本步驟有哪些？2、農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)缺點(diǎn)？3、哪些措施可以提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率？