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《農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實驗指導(dǎo).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、實驗?zāi)康?了解低溫離心機、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺等儀器的使用。2學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理；掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的實驗方法，了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作流程。二、實驗原理農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植
2、物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。實驗一培養(yǎng)基配制一、儀器和試劑1、儀器：高壓滅菌鍋，超凈工作臺2、藥品：Beefextract(牛肉浸膏)5g/L，Yeastextract(酵母提取物)1g/L，Peptone(蛋白胨)5g/L，Sucrose(蔗糖)5g/L，MgSO4.7H2O0.4g/100ml，Agar(瓊脂)1.5g/100ml，MS粉，有機溶液，肌醇，F(xiàn)e鹽，NAA（萘乙酸），6-BA（6-芐氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），鏈霉素（str）。二、實驗方法第
3、一組配制YEB固體培養(yǎng)基1、配制250mlYEB固體培養(yǎng)基：先稱取1.25gBeefextract(牛肉浸膏)；1.25gPeptone(蛋白胨)；0.25gYeastextract(酵母提取物)；1.25gSucrose..(蔗糖)；1gMgSO4.7H2O；瓊脂粉3.75g；將上述藥品置于250ml三角瓶中，用量筒稱取200ml蒸餾水將其溶解混勻，然后再定容至250ml，用NaOH調(diào)pH=7.4。2、滅菌：將盛有250ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌
4、后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60℃時（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/mlStr+50μg/mlrif），以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效。4、倒板：將抗生素與培養(yǎng)基混勻，每個平皿倒15ml培養(yǎng)基，可以倒16個平皿，倒完后打開平皿蓋，在紫外燈下照10min，等待培養(yǎng)基凝固，蓋上平皿蓋，封口備用。第二組配制YEB液體培養(yǎng)基1、配制500mlYEB液體培養(yǎng)基：先稱取2.5gBeefextract(牛肉浸膏)；2.5gPeptone(蛋白胨)；0.5gYeastextract(酵母提取物)；2.5g
5、Sucrose(蔗糖)；2gMgSO4.7H2O；將上述藥品置于500ml三角瓶中，用量筒稱取450ml蒸餾水將其溶解混勻，然后再定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=7.4。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60℃時（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/mlStr+50μg/mlrif），以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效。4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到試管和三角瓶中，每個試管中分裝5m
6、l，分裝12個試管。每個三角瓶中倒入35ml，共12個三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第三組配制MS液體培養(yǎng)基1、配制500mlMS液體培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；..5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機溶液的混合液，然后混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=5.8。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、乙酰丁香酮的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到5
7、0-60℃時（手可觸摸）加入已經(jīng)過濾好的乙酰丁香酮。4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到三角瓶中，每個三角瓶中倒入40ml，共12個三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第四組配制MS共培養(yǎng)基1、配制500mlMS固體共培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照實際需要，根據(jù)母液濃度計算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=5.8，然后再加入7%的瓊
8、脂粉3.5g。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個平皿中倒入25ml，共20個平皿。4、分裝好后，封口備用。第五組配制MS分化篩選培養(yǎng)基1、配制1000mlMS固體共培養(yǎng)基：用2個500ml三角瓶進行盛取，先在500m
